·基础研究·以人皮肤成纤维细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞*杨俊林刘雄昊喻姣玲冯劢谭杨李卓吴奔高庭潘盛邬玲仟梁德生夏家辉（中南大学医学遗传学国家重点实验室湖南长沙410078）摘要目的：比较人皮肤成纤维细胞（human dermal fibroblasts,HDFs ）与小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblasts,MEFs)的增殖能力及研究人皮肤成纤维细胞作为饲养层支持人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs ）未分化生长的能力。
方法：利用组织贴壁法从人皮肤中分离出HDFs ，通过细胞形态的观察和生长曲线的绘制比较HDFs 与MEFs 的体外增殖能力。
将HDFs 作为饲养层细胞与hESCs 共培养，传代12代后，检测hESCs 碱性磷酸酶(AKP)、表面特异性标志及胚胎干细胞特异性转录因子。
结果：HDFs 可连续传代培养15代以上，10代以下的HDFs 增殖迅速，而MEFs 自第4代起，增殖能力就明显下降；hESCs 在HDFs 饲养层上可传代培养12代以上，克隆边界清晰，细胞排列紧密，碱性磷酸酶、表面标志物检测均呈阳性，表达了hESCs 特异性转录因子。
结论：HDFs 比MEFs 具有更强的增殖能力；HDFs 可作为培养hESCs 的饲养层细胞。
关键词：人胚胎干细胞；人皮肤成纤维细胞；饲养层细胞中图分类号：R329.2文献标识码：A 文章编号：1673-6273（2009）16-3001-05Culture of human embryonic cells by using human dermal fibroblasts asfeeder cells*YANG Jun-lin,LIU Xiong-hao,YU Jiao-ling,FENG Mai,TAN Yang,LI Zhuo,WU Ben,GAO Ting,PAN Sheng,WU Ling-qian,LIANG De-sheng,XIA Jia-hui（State Key Laboratory of Medical Genetics,Central South University,Changsha,410078，China ）ABSTRACT Objective:To compare the proliferative potential of human dermal fibroblasts(HDFs)and mouse embryonic fibroblasts (MEFs),and to explore the feasibility for HDFs as feeder cells to support the growth of human embryonic cells (hESCs).Methods:HDFs were obtained from human skin by using the method of tissue-adherence.The proliferative capacities of HDFs and MEFs were compared by cell morphology and growth curve.HDFs were used as feeder cells to culture hESCs.After growing on HDFs for 12passages,the hESCs were tested for the expressions of alkaline phosphatase (AKP),the cell surface markers and cell-specific transcription factor of hESCs.Results:HDFs could be subcultured for more than 15passages,and retained strong proliferative potential before 10passages,while it decreased obviously in MEFs after subcultured for 4passages.The hESCs can passaged on HDFs feeder cells for 12passages with tightly packed cells and clear boundaries of clone,showing the positive results of alkaline phosphatase (AKP)and the cell surface markers and the expression of hESCs-specific transcription factor.Conclusion:HDFs showed a stronger proliferation ability than MEFs;HDFs can support the growth of hESCs.Key words:Human embryonic stem cells;Human dermal fibroblasts;Feeder cells Chinese Library Classification:R329.2Document code:A Article ID:1673-6273（2009）16-3001-05*基金项目：国家重点基础研究发展计划（2004CB518800），国家高技术研究发展计划（2007AA021002和2007AA021206）和国家自然科学基金（30700458和30971298）作者简介：杨俊林（1977-），男，博士研究生，主要研究方向：基因治疗与干细胞生物学，E-mail ：yangjunlin@ 刘雄昊（1975-），男，博士，助理研究员，主要研究方向：基因治疗与干细胞生物学，E-mail ：liuxionghao@ 杨俊林、刘雄昊为并列第一作者△通讯作者：梁德生，E-mail ：liangdesheng@ （收稿日期：2009-07-06接受日期：2009-07-30）前言自1998年Thomson [1]等人建立第一株人胚胎干细胞（hu-man embryonic stem cells,hESCs ）细胞系以来，hESCs 迅速成为人干细胞领域的研究热点。
hESCs 是具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，可以定向分化成不同的细胞、组织，这使得hESCs 在细胞治疗以及再生医学方面具有巨大的潜力。
目前大多数的人胚胎干细胞系是以小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse em-bryonic fibroblasts,MEFs)作为饲养层细胞维持其生长和未分化状态的，MEF 细胞通过与hESC 直接接触及分泌多种因子维持人胚胎干细胞未分化状态。
而鼠源性的饲养层细胞很可能给hESCs 带来动物源性的病原体或生物活性分子的污染，严重阻碍hESCs 的临床应用。
早期就在鼠的细胞发现Hantaan 病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV ）、呼肠病毒-3[2]，这些病毒都有严重的传染性甚至致死的。
另外有研究报道，培养在MEF上的hESCs细胞表面可检测到一种鼠的唾液酸分子Neu5Gc[3]，它在人体内会引发严重的免疫反应。
为了减少动物源性病原体的污染及弥补MEF饲养层增殖能力差的缺陷，建立一个以人源细胞为滋养层的hESCs培养体系显得尤为重要。
本研究采用组织贴壁法从人皮肤中分离出人皮肤成纤维细胞（human dermal fibroblasts,HDFs），并以HDFs作为饲养层与hESCs共培养，建立了一个以HDFs作为饲养层的能较好支持hESCs未分化生长的人源培养体系，使hESCs向临床应用推进一步，同时也为IPS细胞（induced pluripotent stem cells）的人源培养奠定基础。
1材料与方法1.1材料1.1.1人胚胎干细胞系、皮肤组织和实验动物美国加州大学hESCs细胞系HSF6（美国国立卫生研究院干细胞银行注册号为UC06）；皮肤组织来自中南大学湘雅医院外科手术病人，分别取自胸部、腹部、喉部、颈部，皮肤面积约0.5到2.0cm2不等。
所有皮肤组织的采集在病人的知情同意下进行；用于制备小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的ICR孕鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
1.1.2主要试剂Knockout DMEM培养基、DMEM高糖培养基、胎牛血清(FBS)、血清替代物(Knockout serum replacement)、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、非必需氨基酸、双抗、人碱性成纤维生长因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)、分散酶(Dispase)、Ⅳ型胶原酶(Collagenase TypelV)、Trizol试剂和胰酶均购自Invitrogene公司；丝裂霉素C、明胶(Gelatin)购自Sigma公司；碱性磷酸酶(Alkaline phosophotase，AKP)检测试剂盒、胚胎干细胞鉴定试剂盒(ES Cell Characterization Kit)购自Chemicon公司；反转录试剂盒购自Promega公司。
1.2方法1.2.1人皮肤成纤维细胞（HDFs）的分离与培养皮肤组织用含双抗的PBS冲洗后，去除脂肪组织和角质层，剪碎成1mm3大小，去除组织块周围的PBS，将其转至25cm2培养瓶，均匀分布于瓶底，翻转瓶子，加5ml培养基，置于37℃、5%CO2培养箱，待组织块贴壁8-12小时后，再翻转培养瓶使组织块没于培养基中，37℃、5%CO2培养箱培养7-14天左右，每3-4天换液一次。
待HDFs长至80%-90%左右汇合度时，用PBS洗两次，加入适量0.25%胰酶，37℃消化2-3分钟，用完全培养基终止消化，200g离心5分钟，去上清，以1：2比例传代。
1.2.2小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)的分离与培养断颈处死妊娠13.5天的ICR孕鼠，无菌条件下取出整个子宫，将子宫置于含有双抗的PBS中洗涤数次，除去血迹转移到新的培养皿内操作。
无菌眼科剪沿子宫系膜侧剪开子宫，用小镊子撕破胎膜，取出胎鼠，弃除胎膜，用灭菌含有双抗的PBS洗涤胎鼠数次。
用眼科剪去除胎鼠的头部和内脏，再用无菌刀片于无菌培养皿内将胎鼠切成1mm3左右的碎块，加入5ml0.25%胰酶，用10ml吸管上下吸吹5-6次，37℃、5%CO2培养箱中放置5分钟，再补加5ml0.25%胰酶，吸吹均匀，重新放回37℃培养箱中消化，总消化不超过20分钟。