贴壁细胞培养技术课讲义一、克隆形成及克隆形成抑制试验克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆（集落），这时的每个克隆可含50个以上的细胞，大小在0.3-1.0 mm之间。
通过克隆形成实验，可对单个细胞的增殖潜力做出作定量分析，了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性。
这种方法常用于抗癌药物敏感性实验、肿瘤放射生物学实验等。
常见的有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。
平板克隆形成实验本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的肿瘤细胞和正常细胞。
1.准备所需试剂及物品：①含10%及15 %新生牛血清的RPMI-1640培养液（15 ml/组，8组）②PBS③0.25%胰酶④5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），100 μg/ mL（每1mL生理盐水含100ug药物5-FU），（EP管分装，1ml/管x 8）使用前稀释至所需浓度。
⑤甲醇：冰醋酸（3:1）⑥细胞染色液（吉姆萨、甲基绿、刘氏染液选一即可）⑦12孔板（或6孔板）⑧EP管⑨滴管、小瓶等⑩相机、反光板等⑧实验需用的细胞株胃腺癌细胞MGC79012.操作：实验为无菌操作，均需在超净工作台或安全柜中进行。
因此，每次实验前需提前常规将操作台紫外杀菌，乙醇消毒（前已述，在此不多述）。
第一天：⑪制备细胞悬液：取对数生长期胃腺癌细胞MGC7901，用0.25%胰酶消化并吹打成单个细胞，用含15%血清的RPMI-1640稀释，使细胞密度为3×102cell/mL，接种于12孔板，1000 μL/孔。
具体操作如下：①胰酶消化：将培养瓶中原培养液从上面轻轻吸取弃之（可用滴管），加消化液1ml使之均匀分布作用于瓶内贴壁生长的细胞，细胞变形呈圆形颗粒附着于瓶底（镜下可见）即可弃消化液（可用滴管）（一般数十秒甚至几分钟）。
②加入1mlPBS稍摇动瓶，随即吸取弃之（不要直接冲洗细胞）③加入含10 % 血清RPMI-1640培养液6ml冲洗细胞（吸管，轻、均匀，一定要使瓶内细胞充分悬浮！！），再用加样器吸出0.5ml至1.5Ep管，取10ul样品计数。
④根据计数结果，用10% 血清RPMI-1640培养液将瓶中细胞稀释约为4.0（左右）X 104cell/ml (15ml 离心管中) ，再用加样器吸出0.5ml至1.5Ep管，取10ul样品计数。
注意：此为所有实验用细胞，保存好无污染！⑤取上细胞悬液稀释两次：取上面计数好的细胞悬液1ml至15mL离心管中，再加9ml 10% 血清RPMI-1640培养液，混匀后，再从此细胞悬液中取1ml 加入到小瓶中，加13 ml 15%血清RPMI-1640培养液（具体操作：先加12mL 10%RPMI-1640培养液，再加1ml的小牛血清）mix，充分悬浮。
此时约为300个细胞/ml，准备进行克隆形成实验。
⑫种板：12孔板，每孔用加样枪加 1 ml ⑤稀释好之细胞（注意：种板时要不时轻摇小瓶，适时吹打，保持细胞悬浮状态；种板时要轻缓，不要快速将细胞悬液注入孔中；种板后，不要摇动）。
放入5％CO2，饱和湿度条件培养箱内孵育37℃过夜培养第二天实验前，操作台例行消毒（至少提前30分钟）⑬克隆形成及抑制实验①至培养箱中取出过夜培养之细胞，贴壁生长良好。
②加入药物，本实验为5-氟尿嘧啶。
设6组，每组2复孔，转染后置37℃，5％CO2，饱和湿度条件培养箱内孵育4天5-Fu 0 ~5μg/ml具体配制：准备五支1.5ml Ep（对照孔直接加培养基），分别配制好上表中各组不同5-Fu浓度试剂后，再加入培养板孔中。
每组为两个复孔，多计算一孔，每组试剂用量均*3（以免加量不准，多备）。
2组：5-Fu 30 ul + 培养液270 ul（10ul*3孔=30ul 90ul*3孔=270ul）3组：5-Fu 60 ul + 培养液240 ul4组：5-Fu 90 ul + 培养液210 ul5组：5-Fu 120 ul + 培养液180 ul6组：5-Fu 150 ul + 培养液150 ul混匀后每孔按分组加入100ul配制溶液。
③震荡混匀（加药后不要摇动）④放入CO2孵箱中继续培养4-5天（根据对照空细胞生长情况而定）第五或第六天⑭细胞固定（或省去该步骤）吸去培养液，加入PBS洗涤后，用甲醇:冰醋酸固定10 min。
⑮染色：刘氏染色法①加Liu A Solution (约0.5 ml~0.8 ml) 染色30 s。
②滴加Liu B Solution于A液上面(滴加量约为A液的两倍)，混合，染色1 min。
③水洗，干燥，镜检。
⑯倒置显微镜下计数细胞克隆(>20个细胞记一个克隆)并拍照。
克隆形成抑制率= (对照组细胞克隆数–实验组细胞克隆数)对照组细胞克隆数×100％。
二、MTT比色法MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法。
实验所用的显色剂是一种能接受氢原子的染料。
化学名3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐。
商品名噻唑蓝，MTT。
活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的兰紫色结晶物，并沉积在细胞中。
而死细胞无此功能。
二甲基亚砜DMSO能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在570nm 波长处测定其吸光值，可间接反应活细胞数量，在一定的范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。
与其他检测方法如细胞计数法，H3掺入法，LDH法有良好的相关性。
1.准备所需试剂及物品：①MTT液：称取250mgMTT，放入小烧杯内，加50ml PBS（0.01M，pH7.4）在电磁力搅拌仪上搅拌30min。
用0.22 um的微孔滤器除菌，分装4度保存，2周内有效。
②10 %新生牛血清的RPMI-1640，0.25%胰酶，DMSO（分析纯）③5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），用无菌生理盐水配制成100 μg/ mL溶液，使用前稀释至所需浓度。
④ 96孔板2.操作：实验所需时间4天实验为无菌操作，均需在超净工作台或安全柜中进行。
因此，每次实验前需提前常规将操作台紫外杀菌，乙醇消毒（前已述，在此不多述）。
具体操作：2块96孔板，MTT与WST两方法同时做。
一块用MTT检测，一块用WST检测（方法基本同MTT法，见后）第一天①接种细胞，取上克隆形成实验④中计数好之细胞4 X 104cell/ml，每孔120 μL，接种到96孔板（为防止边缘效应，96孔板四周每孔加120uL 的PBS或生理盐水）。
每组3个复孔，分6组（见下表）。
每块板加18孔即可。
注意：保存细胞悬浮状态，以免时间过长细胞沉淀影响每孔细胞浓度。
37℃，5％CO2，饱和湿度条件培养箱内孵育过夜第二天②加入药物40 ul/孔③药物浓度及配制5 – FU 约0——25 μg/ml具体配制：准备五支1.5ml Ep（对照孔直接加培养基），分别配制好上表中各组不同5-Fu浓度试剂后，再加入培养板孔中。
每组为三个复孔，多计算一孔（以免加量不准，多备）。
两块板（MTT与WST两法）一起配制。
2组：5-Fu 32 ul + 培养液288 ul（4ul*8孔=32ul 36ul*8孔=288ul）3组：5-Fu 48 ul + 培养液272 ul4组：5-Fu 96 ul + 培养液184 ul5组：5-Fu 192 ul + 培养液128 ul6组：5-Fu 288 ul + 培养液32 ul混匀后每孔按分组加入40ul配制溶液。
37℃，5％CO2，饱和湿度条件培养箱内孵育培养48 h。
第四天④每孔加入MTT（5mg/ml）20ul，继续培养4 h后。
小心吸弃孔内的上清液。
⑤每孔加入150 ul的DMSO，震荡10 min，酶标仪中570 nm 测吸光值。
注意事项：1.选择适当地的细胞接种浓度：一般情况下，96孔板孔内贴壁细胞长满时约有100,000个细胞，但由于不同细胞贴壁后所占面积差异很大，因此，进行MTT实验前，对每一种细胞都应测定贴壁率，倍增时间，以及接种细胞数条件下的生长曲线，然后测定实验中每孔接种细胞数和培养时间，以保证培养终止时不致细胞过满，保证MTT结晶形成的量与细胞数呈良好的线性关系。
2.避免血清干扰。
呈色后，吸尽空内残存培养液。
否则影响显色。
三、Cell Counting Kit-8（CCK-8试剂）WST法基本原理：该试剂中含有WST–8［其化学名称为：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐］，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臢染料（Formazan dye）。
生成的甲臢物的数量与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
CCK-8试剂中已预先配入了进行细胞增殖和毒性分析所需的成分，无需再用缓冲液或培养基进行稀释；同时，CCK-8试剂无需任何放射性同位素和有机溶剂。
因此，无需特别的技巧，就可使每一位使用者准确、快速地得到重现性好的实验结果。
操作：同MTT同时操作取对数生长期的细胞，用含10 %新生牛血清的1640培养液调细胞浓度为4.2×104 cells/mL，每孔120 μL，接种到96孔板.置37 ºC、5 % CO2 孵箱中培养48 h，每孔加入WST试剂10 μL，继续孵育90 min，多功能酶标仪(Bio-Rad)测定吸光度A450nm (激发波长450 nm，参比波长655 nm)，计算细胞的增殖抑制率。
（对照组呈粉红色）增殖抑制率=(对照组吸光度-实验组吸光度)/对照组吸光度×100%。