紫外分光光度法测定槐花中总黄酮含量的方法学验证（实验报告）实验日期温度相对湿度
实验人员学号
一、实验目的
1、掌握比色法测定槐花药材中总黄酮含量的方法及原理
2、掌握方法学验证并证明采用的方法适合于相应的检测要求
二、实验原理
槐花药材的主要有效成分是黄酮类化合物，其中芦丁的含量最高，所以槐花药
材的鉴别及含量测定均以芦丁为指标成分。
黄酮类化合物在碱性条件下与铝盐发生配位反应，生成红色的配位化合物，使
得最大吸收波长红移至可见光区，且具有较高的吸收系数。
黄酮类与铝盐的配位
反应是定量完成的，因此可采用比色法测定槐花药材中黄酮的含量，避免其他非
黄酮成分对测定准确度的影响。
药品质量标准分析方法验证的目的是证明采用的方法适合于相应检测要求，在
建立药品质量标准时，分析方法需经验证。
本次实验所进行的是槐花总黄酮含量
测定的方法学验证，验证内容包括线性、精密度、重现性、稳定性、准确度（回
收率）。
三、仪器与试剂
仪器：紫外-可见分光光度计，电子天平，玻璃比色皿，超声仪，25ml量瓶（15个），100ml量瓶（10个），150ml锥形瓶（6个），100ml量筒（2个），50ml烧
杯（7个），洗耳球（2个），洗瓶(2个)，胶头滴管（2支），药匙（2支），玻棒
（2支），移液枪（2支），移液枪头（若干），长颈漏斗（4个），1ml吸量管（3支），2ml吸量管（2支），5ml吸量管（2支），10ml吸量管（2支），500ml烧杯
（1个）
试剂：槐花药材，芦丁对照品，5%亚硝酸钠溶液，10%硝酸铝溶液，氢氧化
钠试液，甲醇，乙醇
四、实验步骤
1．供试品溶液的制备：
将槐花研碎，取粗粉约1g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入60%（v/v）
乙醇100ml，称定重量，超声30分钟，取出冷却至室温，用60%（v/v）乙醇补
足失重，摇匀，过滤，取续滤液10ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
2．对照品溶液的制备：
取芦丁对照品50mg，精密称定，置于25ml量瓶中，加甲醇适量，置水浴上微
热时溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀。
精密量取10ml，至于100ml量瓶中，
加水至刻度，摇匀，即得浓度为0.2mg/ml的芦丁对照品溶液。
3．标准曲线的制备
精密量取对照品溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml，分别置于6个25ml量瓶中，各加水使成6.0ml，精密加5%亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6分钟，再加10%硝酸铝溶液1.0ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10.0ml，加水稀释至刻度，摇匀，放置15分钟，不加对照溶液同法配制空白溶液，按照紫外可见分光光度法，在500nm波长处测定各溶液的吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标注曲线并采用二元线性回归方法求出回归方程及相关系数。
(判断依据r>0.999)
4.测定法：
精密量取3.0ml，置25ml量瓶中，按照标准曲线制备项下的方法，自“加水使成6.0ml”起，同法测定吸光度，由标准曲线计算出供试品溶液中芦丁的含量。
槐花按干燥品计算，含总黄酮以芦丁（C27H30O16）计，槐花不得少于8.0%,槐花米不得少于20%。
5．方法学验证
5.1线性关系的考察
芦丁对照品线性关系考察结果
对照品称取量：
吸光值（A）
1
2
3
4
5
6
标准曲线的绘制：
回归方程及相关系数：
取标准曲线的制备实验中已配置好的含有4.0ml 对照品溶液的样品在500nm 处重复测定6次，并计算RSD%，RSD%应小于等于2.0%。
精密度试验
试验次数 1 2 3 4 5 6 均值 RSD% 吸光度
5.3重复性试验
同一个人取同一批次槐花粗粉约1g 六份，按照供试品溶液的制备和测定法项下操作，计算含量和RSD%，RSD%应小于等于2.0%。
重复性考察
编号 1 2 3 4 5 6 均值 RSD%
称取量（g ） 吸光度（A ） 含量（mg/g ）
含量的计算：
公式：A=aC+b C=
含量（%）= C ×D ×100%
C 为检测液浓度（mg/ml ）、
D 为稀释体
积（ml ）、W 为称取量 W
样品1含量（%）＝
样品2含量（%）＝
样品3含量（%）＝
样品4含量（%）＝
样品5含量（%）＝
样品6含量（%）＝
含量%平均值： RSD%：
A —b
a
取标准曲线的制备实验中已配置好的含有3.0ml对照品溶液的样品在500nm处，分别在0、15、30、45、60、75min后进行测定，计算RSD%，RSD%应小于等于2.0%。
稳定性试验
时间（min）0 15 30 45 60 75 均值RSD% 吸光度
5.5槐花样品含量测定
由重复性试验的结果可得：
样品含量测定
编号 1 2 3 4 5 6 均值RSD% 称取量（g）
吸光度（A）
含量（mg/g）
（标准规定：槐花按干燥品计算，含总黄酮以芦丁（C27H30O16）计，槐花不得少于8.0%，槐花米不得少于20%。
）
5.6加样回收率试验
5.6.1标准曲线的制备
按实验步骤3，重新制备标准曲线。
标准曲线的绘制
对照品称取量：
吸光值（A）1
2
3
4
5
6
标准曲线的绘制：
回归方程及相关系数：
5.6.2加样回收试验
精密称取已知含量的槐花粗粉约0.5g，9份，分别置于9个150ml锥形瓶中，分为高、中、低三组，按高、中、低质量浓度分别加入芦丁对照品，高浓度组加入0.5g槐花粉末所含总黄酮质量的120%；中浓度组加入0.5g槐花粉末所含总黄酮质量的100%；低浓度组加入0.5g槐花粉末所含总黄酮质量的80%，接着按供试品溶液的制备和测定法项下操作，计算数据，一般回收率应为98%—102%，RSD%应小于等于2.0%。
加样回收试验
样品序号吸光度
A
槐粉本
底量
/mg
加入量
/mg
测得量
/mg
回收率
(%)
平均回
收率(%)
RSD%
高浓度120% 样品1 样品2 样品3
中浓度100% 样品4 样品5 样品6
低浓度80% 样品7 样品8 样品9
回收率公式：
样品1回收率（%）=
样品2回收率（%）=
样品3回收率（%）=
样品4回收率（%）=
样品5回收率（%）=
样品6回收率（%）=
样品7回收率（%）=
样品8回收率（%）=
样品9回收率（%）=
平均回收率： RSD%：
回收率（%）=
测得量—本底量 ×100%
加入量
五、实验讨论。