启动子活性分析（双荧光素酶报告基因实验）
一、实验目的：分析启动子活性
二、实验原理：荧光素酶报告基因的活性用Dual-Luciferase®Reporter Assay
System（Promega）试剂盒来检测。

利用单通道多标记荧光检测仪测定荧
光素酶活性。

在双荧光素酶系统中，除了用于检测启动子活性的萤火虫
荧光素酶外，另外一种组成型表达的Renilla荧光素酶质粒PRL-TK也被
同时转染入细胞内作为内参。

三、实验材料：Dual-Luciferase®Reporter Assay System（Promega）试剂盒，
PBS，细胞裂解液，96孔，
四、实验设备：单通道多标记荧光检测仪
五、实验方法及步骤：
1）启动子萤光素酶报告载体与共转染质粒按照质量等比例、总量0.8μg的原则转染细胞，36h后收获细胞；
2）96孔板吸弃细胞培养基，PBS冲洗细胞一次，加入1×PLB细胞裂解液20μl，置于室温震荡裂解20min；
3）轻轻吹打细胞，取10μl细胞裂解液加入50μl Luciferase Assay Reagent，轻轻震荡混匀，立刻置于单通道多标记荧光检测仪中测定Firefly Luciferase活性；
4）读数后立即加入50µl Stop & Glo®Reagent轻轻震荡混匀，读取Renilla Luciferase活性；
5）所得的结果为各个实验样品的Firefly Luciferase活性与Renilla荧光素酶活性的比值。

每个实验组重复3-4孔，整个实验独立重复3次。

实验结
果均为3次独立的实验结果的平均值。

所有的结果均以平均值±标准差
(mean±S.D.)表示。

六、注意事项
1.做好对照。

2.多做几个复孔，求平均值。

七、补充知识点
双荧光素酶报告基因实验
1.试剂盒：Dual-Glo TM Luciferase Aassy System（promega E2920）组成如下：• Dual-Glo™萤光素酶缓冲液
• Dual-Glo™萤光素酶底物（冻干粉）
• Dual-Glo™Stop-Glo®缓冲液
• Dual-Glo™Stop-Glo®底物
2.报告基因的作用
• 细胞信号转导途径
• 启动子/增强子
• 受体结合
• 病毒/细胞相互作用
• 转录因子
• 药物诱导作用或“效果”
3.原理
–制备含有luc/ R luc的DNA
–转染
–提供刺激
–测量荧光
–用海肾萤光素酶作对照归一实验变化
归一反应=实验的(萤火虫萤光素酶)/ 对照的（海肾萤光素酶)
4.载体- 萤火虫萤光素酶载体
•pGL3 家族
pGL3-Basic
pGL3-Control
pGL3-Enhancer
pGL3-Promoter
海肾萤光素酶报告基因载体
pRL-TK
5.试剂制备
–将Dual-Glo™ 萤光素酶缓冲液倒入Dual-Glo™ 萤光素酶底物中，
Dual-Glo™ 萤光素酶试剂，分装后-70℃保存，避免反复冻融
–用Dual-Glo™ S top &Glo® 缓冲液按1:100 稀释Dual-Glo™ Stop &Glo® 底物（现用现配）
–所有的缓冲液存于室温, 所有的底物存于–20°C
两步加入试剂：加，读，加，读
6.检测步骤：
实验前，将Dual-Glo™ 萤光素酶试剂平衡到室温
1.确认使用的细胞板可以用于荧光检测
2.测萤火虫荧光素酶活性：向待测细胞板每孔中加入与培养基等体积的
Dual-Glo™ 萤光素酶试剂，混匀。

例如96孔板，一般会加入75ul与孔中培养基等体积的试剂。

3.孵育至少10分钟，测萤火虫荧光值。

荧光值在加入Dual-Glo™ 萤光素酶试
剂后2小时之内较稳定。

4.测海肾荧光素酶活性：向待测细胞板每孔中加入与开始的培养基等体积的
Dual-Glo™ Stop &Glo®试剂，混匀。

与第二步类似，若用的是96孔板，则加入75ul试剂。

注意：Dual-Glo™ Stop &Glo®试剂要在加入Dual-Glo™ 萤光素酶试剂后4小时之内加入。

5.孵育至少10分钟，测海肾的荧光值。

荧光值在加入Dual-Glo™ Stop &Glo®
试剂后2小时之内较稳定。

6.计算结果=实验的(萤火虫萤光素酶)/ 对照的（海肾萤光素酶)。