迅速中入4ml 1％柠檬酸三钠水溶液，可 见溶液很快变蓝至橙红色。
柠檬酸三钠与胶体金颗粒直径的关系
0.01%HAucl4 1％柠檬酸三钠(ml) 直径(nm)
100
5.0
10.0
100
4.0
15.0
100
1.5
25.0
100
1.0
50.0
100
0.75
60.0
100
0.60
70.0
100
0.42
98.0
4℃过夜，PBS洗3×3min，1％EA 37℃ 15min。
(5)PAG 1:40-1:50 37℃ 1h ，PBS洗3×3min。 (6)1％EA 15min 37℃。 (7)抗SPA抗体1:200 37℃ 40min，PBS洗
2.待标记蛋白质 通过透析法除去多余 的电解质。长期低温保存的蛋白质，临 用前需100000g 4℃离心1h，去除聚合的 蛋白质，尤其在浓度高于2mg/ml的情况 下。
3.胶体金应用0.1mol/L K2CO3或 0.1NHCL调 节 pH值在待标记蛋白的等电点或略偏碱。
各种蛋白质、酶的等电点
抗SPA抗体上的Fab段和Fc段与PAG上的A 蛋白结合，再用PAG，使它在抗原抗体结 合部位聚集更多的胶体金颗粒，其敏感性 大大提高。
操作步骤如下： (1)石蜡切片脱蜡至水。 (2)消化或抗原修复，PBS洗3×3min。 (3)1％卵蛋白（EA） 15min，37℃。 (4)适当稀释一抗（在间接法基础上100倍稀释)
名称
等电点 名称
等电点
IgG
9.0
DNA酶
6.0
F(ab)2
7.2
RNA酶
9.0~9.2
McAb
8.2
低密度脂蛋白 5.5
SPA
5.7~6.2 Avidin
10~10.6
HRP
7.2~8.0 Streptavidin 6.4~6.8
BSA
5.2~5.5 Lectin
8.0
胰岛素-BSA结合物 5.3
免疫胶体金组化技术
主要内容
一、免疫胶体金技术发展史 二、溶胶的基本概念 三、胶体金的制备方法 四、胶体金探针制备 五、光镜免疫金银组织化学
思考题： 1.胶体金的概念，胶体金有哪些特性？ 2.影响溶胶稳定性的因素有哪些？ 3.制备胶体金的还原剂有哪几种？ 4.有哪几种经典的胶体金制备方法？
5.胶体探针的纯化方式有哪二种，请叙述他 们的过程？
蒸馏水60ml。 ②加入1％的HAucl4水溶液0.75ml，加
0.1mol/L K2CO3 0.6ml，振荡变成棕色。 ③加热煮沸，至透明红色。
胶体金颗粒大小与还原次数之间的关系
还原次数
颗粒直径(nm) 正负误差
1
5.6
0.9
2
6.7
0.9
3
7.9
0.9
4
9.8
1.3
5
12
1.0
(2)柠檬酸三钠还原法(Frens 1973) 取0.01%氯化金溶液100ml加热至沸腾，
①将浓缩好的胶体金以1500r/min离心 去掉大的聚合物，吸取上清待过柱。 ②柱高34cm，直径1cm，加样体积为 柱床体积的1/10。
③丙烯葡聚糖S-400（Sephacryls-400）装 柱后用0.02mol/L pH8.2 TBS平衡层析柱 （pH7.4者用于标记的SPA），平衡好后， 吸取上清胶体金液加入层析柱上，加样时 不要破坏S－400胶面。
3.1974年Romano和他的同事们将胶体金 标记在马抗人IgG上，实现了间接免疫金染 色法。
同年Bauer等报道将胶体金标记在凝集 素上的应用。
4.1978年Geoghegan等应用免疫金技术检测B 淋巴细胞表面抗原。
5.1981年Danscher建立了银显影液增强光镜 下金颗粒的免疫金银染色方法 （Immunogold-silver staining, IGSS）。
6IGSS技术的优点有哪些？ 7.IGSS技术存在的问题和克服的办法有哪些？
一、免疫胶体金技术发展史
1.1939年Kausche和Ruska把烟草叶病 毒吸附在金颗粒上，电镜下观察呈高电子 密度细颗粒状。
2.1971年Faulk和Taylor首先将兔抗 沙门菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接 IHC检测沙门菌的表面抗原。
三、胶体金的制备 1.制备前的准备 (1)玻璃器皿的清洁 制备胶体金的成功与 失败除试剂因素以外玻璃器皿清洁是非常 关键的一步。
其清洁流程如下：清洁液泡24h，自流水洗 净，洗洁剂洗3～4次，流水冲洗干净，蒸 馏水洗4～5次，烤箱烤干备用。如果条件 允许，可将器皿进行硅化。
(2)试剂的配制要求 所有配制试剂的 容器均按上述要求清洗，配制试剂用双 蒸馏水或去离子水。
④流速为8ml/h，待胶体金全部进入界面后， 再加缓冲液，大约几小时后，可见先滤出 液体呈微黄色，有时略浊，内含大颗粒聚 合物等杂质，待红色出现可收集，最后肉 眼可见黄色终止收集。
7.胶体金探针的质量鉴定 (1)电镜下测定金颗粒大小，均匀程度。 (2)纸膜试验 (3)IGSS或免疫电镜IGS法
8.胶体金探针的保存 (1)SPA金标探针因易形成凝集物，不
之间，吸收波长520nm，呈红葡萄酒色； 20～40nm之间吸收波长530nm，呈深红色； 60nm的金溶液主要吸收波长600nm为橙黄 色光，液体呈蓝紫色。
(2)胶体金的稳定性 其稳定介于小分子 离子和粗分散体系之间，即稳定，又容 易出现聚沉。影响溶胶稳定性的主要原 因有三点：①胶粒间的相互吸引力；② 胶粒及其溶剂化层的带电情况；③胶体 界面的溶剂膜。
2.胶体金制备的方法 胶体金的制备方法很多，其中应用较
为广泛的方法是化学还原法。这一方法的 基本原理是在氯化金水溶液中加入一定的 还原剂，使金离子还原成金原子。可用于 制备胶体金的还原剂有50余种，但常用的 还原剂仅以下三种：即白磷、柠檬酸三钠 以及鞣酸。
(1)改良的白磷还原法(Henegouwen,1986) ①取20％饱和度白磷乙醚溶液0.5ml，加
能冷冻贮存。 (2)用0.01% NaN3 PBS溶液混悬复合
物，在4℃中，可稳定数月。
(3)用柠檬酸三钠制作的SPA金标探针可保 存一年以上。 (4)用白磷制备的SPA金标探针最多稳定4 周。
五、光镜免疫金银组织化学 (一)免疫金染色 1.概述：1978年，Geoghegan等首次应
用免疫金探针检测B淋巴细胞表面抗原， 建立了免疫金法（Immunogold staining,IGS），
(1)离子分散体系 分散相以小分子或离 子状态存在（分散相粒子小于1nm）。 具有高度的稳定性。
(2)胶体金分散体系 指分散相颗粒在1～ 100nm之间，外观透明不浑浊，在普通 显微镜下看不见。
(3)粗分散体系 指颗粒大于100nm，不稳 定，显微镜下可见。
2.胶体金的一般性状 (1)胶体金的颜色 颗粒在5～20nm
小不同，其离心力也不完全一致。
离心力与金颗粒直径的关系 4℃ 1h
颗粒直径(nm) 离心力(g) 颗粒直径(nm) 离心力(g)
2－3
125000
10－15
64000
4－5
120000
15－20
14000
6－8
100000
轻轻地倒去上清（无色），取松散的 红色沉淀，底部深暗色物不要吸取。
(3)凝胶过滤法 将胶体金与蛋白结合 装入透析袋内，硅胶中浓缩至原体积 十分之一左右，用蒸馏水冲洗软化透 析袋后，按如下流程操作：
目测法列表说明
管数 胶体金(ml) 蛋白质(μg) 10%Nacl(ml)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 111 1 11111 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
(3)估计量： 10ml 15nm胶体金＋30μg蛋白质 10ml 3nm胶体金＋60μg蛋白质 10ml 8～13nm胶体金＋8μg蛋白质
α-球蛋白
6.0
4.确定胶体金与待标记蛋白质用量 (1)光电比色法
制备一系列不同浓度的等体积蛋白质溶 液（1ml），分别加入到5ml胶体金中，迅速 混均，然后各加入1ml10％ Nacl溶液，摇匀， 静置5min后测各管，根据金颗粒大小，测OD 值(520～580nm)，绘制示意图。
取曲线最先与横轴相接近那一点为蛋白 质最稳定量。 (2)目测法
(2)胶体金颗均匀度的测定 一般需测量100个以上的胶体金颗粒，
然后用统计学处理，计算胶体金颗粒的平 均直径及标准差。
（3）影响胶体金颗粒大小的因素 如果总数超过10％以上大小不等的金
颗粒及椭圆形、三角形金颗存在应重新制 备。其原因如下：
①还原剂不是一次快速加入。 ②容器太大或太小及加温至100℃时间
100
0.32
147.0
100
0.25
160
(3)鞣酸---柠檬酸三钠还原法(slot 1985)
A液：1％氯化金1ml蒸馏水Fra bibliotek79ml
B液：1％柠檬酸三钠 4ml
1％鞣酸
0.1ml
25mmol/L K2CO3 0.1ml
蒸馏水
15.8ml
将上述A液加温到60℃，然后将B液 快速加入到A液中，在10min内煮沸，此 时颜色由黑→蓝→亮红。
IGS法的特点是染色程序简便，不要显色， 染色时免疫金法一般要求金颗粒的直径大 于20nm，并且用的浓度较高。
2.IGS步骤 (1)石蜡切片脱蜡至水。 (2)消化或抗原修复，PBS洗3×3min。 (3)1％卵蛋白（EA） 15min 37℃。 (4)适当稀释一抗 37℃ 1h，或4℃过夜， PBS洗3×3min。