细胞免疫组化步骤1. PBS冲洗两次2. 丙酮固定10min3. 浸入0.75%H2O2-PBS(30%H2O2 0.05 ml+PBS 2ml) 37℃30 min4. PBS振洗2次,每次3min5. 加封闭血清,湿盒内37℃30 min6. 弃去血清7. 加一抗, 37℃30~60min (1:200 1:150稀释)8. PBS振洗3次,每次3min9. 加二抗, 37℃30 min10. PBS振洗3次,每次3min11. 加ABC复合剂, 37℃30 min12. PBS振洗2次,THB(Tris-HCl缓冲液0.5mol/l,PH 7.6 )振洗1次,每次3min13. 浸入新鲜底物溶液（DAB50mg+100ml THB）,在室温下暗处10~20min14. 自来水洗5min15. 染核浸入苏木素染液2min,自来水洗，迅速过盐酸酒精，自来水洗，过氨水，自来水洗16. 逐级脱水，70％1次，95％2次，无水3次每次1min17. 透明，过二甲苯3次，每次1min18. 封片将有细胞的一面向下封片一、免疫组化操作规程（一）、仪器设备1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2）水浴锅（二）、试剂1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。

2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。

3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。

4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。

5）酶消化液：a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。

b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl 配制。

6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。

7）封裱剂：a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合；b、油和TBS(或PBS)配制。

8）TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。

（三）、操作流程1、脱蜡和水化脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。

1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；2）无水乙醇中浸泡5分钟；3）95%乙醇中浸泡5分钟；4）70%乙醇中浸泡5分钟；2、抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。

1）抗原热修复（1）高压热修复在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。

盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。

将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。

10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。

本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。

（2）煮沸热修复电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。

（3）微波热修复在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。

适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。

2）酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。

胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30 分钟。

适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。

3、免疫组织化学染色SP法1）脱蜡、水化；2）PBS洗2～3次各5分钟；3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；4）PBS洗2～3次各5分钟；5）抗原修复；6）PBS洗2～3次各5分钟；7）滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。

甩去多余液体。

8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。

9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。

10）PBS洗3次各5分钟；11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；12）II抗中可加入0.05%的tween-20。

13）PBS洗3次各5分钟；14）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；15）PBS或自来水冲洗10分钟；16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；17）自来水冲洗10～15分钟；18）脱水、透明、封片、镜检。

SABC法1)脱蜡、水化。

2)PBS洗两次各5分钟。

3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。

4)抗原修复。

5)PBS洗5分钟。

6)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。

甩去多余液体。

7)滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。

8)PBS洗三次每次2分钟。

9)滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分钟。

10)PBC洗3次每次2分钟。

11)滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟。

12)PBS洗4次每次5分钟。

13)DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。

14)蒸馏水洗。

苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。

15)脱水、透明、封片、镜检。

二、原位杂交操作规程（一）、仪器设备医用微波炉；水浴锅。

（二）、试剂0.2mol/L HCl：HCl 8.2ml，H20 定容0.5L。

0.1mol/L三乙醇胺(pH8.0):三乙醇胺5.33ml，H20 定容0.4L。

.5ml/L醋酸-2.5ml/L醋酸酐:三乙醇胺13.2ml，NaCl 5g，浓HCl 4ml，H20 定容0.98L，醋酸酐（用前加）2.5ml。

20×SSC(pH7.0)：NaCl 175.3g，枸橼酸钠88.2g，H20 定容1L。

100×Denhardt's：Ficoll 1g，PVP 1g，BSA 1g，H20 定容50ml。

杂交液：Formamide 5ml，20×SSC 2.5ml，Dextran sulfate 1g，100×Denhardt's 0.5ml，10%SDS 0.5ml，10g/L sperm DNA 0.1ml，H20 1.4L。

BufferⅠ（pH7.5）：0.1mol/L Tris·Cl，0.15mol/L NaCl。

BufferⅢ（pH9.5）：0.1mol/L Tris·Cl，0.1mol/L NaCl，0.05mol/L MgCl2。

BufferⅣ（pH8.0）：10mmol/L Tris·Cl，1mmol/L EDTA。

（三）、操作流程1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天1）二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟；2）无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；3）95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；4）PBS清洗3分钟；5）2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6）PBS清洗10分钟；7）加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育15分钟；8）PBS清洗2次，每次3分钟；9）0.2N的HCl孵育30分钟；10）PBS清洗2次，每次3分钟；11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗2次，每次5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85℃加热5分钟，置于冰块中10分钟；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；17）PBS清洗3分钟；18）RNA酶A溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中），37℃孵育30分钟；19）PBS清洗5分钟；20）室温，2×SSC清洗10分钟；21）37℃，1×SSC清洗10分钟；22）37℃，0.5×SSC清洗10分钟；23）缓冲液A孵育10分钟；24）缓冲液A（1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100）孵育30分钟；25）加入抗地高辛抗体（1/200的上述缓冲液，来自Boehringer Mannheim），37℃孵育3 小时；26）缓冲液A清洗2次，每次10分钟；27）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；28）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时；29）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；30）固红，脱水以及封片进行核的复染。

2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天1）二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟；2）无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；3）95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；4）PBS清洗5分钟；5）2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6）PBS清洗5分钟；7）加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育10分钟；8）PBS清洗2次，每次5分钟；9）0.2N的HCl孵育30分钟；10）PBS清洗2次，每次5分钟；11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中以去除封片；17）室温，2×SSC清洗10分钟；18）37℃，1×SSC清洗10分钟；19）37℃，0.5×SSC清洗10分钟；20）缓冲液A孵育10分钟；21）缓冲液A孵育30分钟；22）加入抗地高辛抗体37℃孵育3小时；23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟；24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；27）固红，脱水以及封片进行核的复染。

三、原位聚合酶链式反应（in situ PCR）和原位反转录聚合酶链式反应（in situ RT-PCR）操作规程（一）、仪器设备英国Thermo Hybaid原位PCR仪。