RNA 的提取TaKaRa Code：D9108A1. RNAiso Plus的使用量情况如下。

2. 实验样品的研磨和匀浆。

A. 贴壁培养细胞①倒出培养液，用1×PBS清洗一次。

②每10 cm2生长的培养细胞中加入1 ml的RNAiso Plus，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞使其脱落（对于贴壁牢固的培养细胞可用细胞刮勺剥离细胞）。

③将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。

④室温静置5分钟。

B. 悬浮培养细胞①将悬浮培养细胞连同培养液一起倒入离心管中，8,000 g 4℃离心2分钟，弃上清。

②向每107个细胞中加入l～2 ml的RNAiso Plus。

③用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。

④室温静置5分钟。

C. 动物组织、植物材料样品①将超低温冻结的RNA提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，直至研磨成粉末状（无明显的可见颗粒，如果没有研磨彻底会影响RNA的收率和质量）。

②对于普通的RNA提取样品，可以向研钵中加入适量的RNAiso Plus，将研磨成粉末状的样品完全覆盖，然后室温静置，直至样品完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。

对于特殊样品，如肝、脾、骨及软骨等，可以将研磨成粉末状的样品加入到含有适量的RNAiso Plus的匀浆管中，把匀浆管置于冰浴中进行匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状。

③将匀浆液转移至离心管中，室温静置5分钟。

④ 12,000 g 4℃离心5分钟。

⑤小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀）。

3. Total RNA的提取。

①向上述步骤2的匀浆裂解液中加入氯仿（RNAiso Plus的1/5体积量），盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15秒（氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开）。

待溶液充分乳化（无分相现象）后，再室温静置5分钟。

② 12,000 g 4℃离心15分钟。

③从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。

吸取上清液转移至另一新的离心管中（切忌吸出白色中间层）。

④向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10分钟。

⑤ 12,000 g 4℃离心10分钟。

一般在离心后，试管底部会出现沉淀。

4. RNA沉淀的清洗。

小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇l ml（切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000 g 4℃离心5分钟后小心弃去乙醇（为了更好地控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇）。

5. RNA的溶解。

室温干燥沉淀2～5分钟（不可以离心或加热干燥，否则RNA将会很难溶解，有关RNA溶解可以参考Troubleshooting中的相关说明），加入适量的RNase-free水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。

简易流程有关RNA 的吸光度说明如下：260 nm 、320 nm 、230 nm 、280 nm 下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白质等有机物的吸光度值。

OD260/OD28O （R ）体现了RNA 中的蛋白质等有机物的污染程度，质量较好的RNA 的R 值应在1.8～2.2之间，当R<1.8时，溶液中的蛋白质等有机物的污染比较明显；当R>2.2时，说明RNA 已经被水解成了单核苷酸。

在对核酸进行吸光度检测时，需要注意稀释液应使用TE Buffer 。

RNA 浓度=（OD260-OD320）×稀释倍数×0.04 μg/μlRNA 质量验证一般的，RNA 的电泳都是用变性胶进行的，但是，如果你仅仅是为了检测RNA 的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的，用普通的琼脂糖胶就可以了。

我们用的是1.5%的琼脂糖凝胶电泳，如果提取出的总RNA 如果完整性好，没有降解，电泳后应能清晰的看到28s 和18s 两条带，并且28S 是18S 的两倍。

两条带若不明显呈弥散状态，则说明RNA 已经部分降解，可能是污染了ＲＮａｓｅ或操作剧烈。

使用非变性电泳检测 RNA ，当用 1.0 - 1.2% 的进口品牌 Agarose 电泳，以 DNA Marker 做对照，28S 和 18S 条带分别在 2kb 和 0.9kb 左右 200ul 40ul40ul．材料与方法1 材料RNA样品2 仪器、用具电泳仪、电泳槽、凝胶样品梳、微波炉、移液器等3 试剂(1) 1×T BE 电泳缓冲液(2) 溴化乙锭溶液（EB）[有毒，小心操作](3) 琼脂糖(4) 6×加样缓冲液4 方法(1) 选择孔径大小适合的点样梳，垂直架在胶版的一端，使点样梳底部离电泳槽水平面的距离为0.5-1mm。

(2) 称取300mg琼脂糖，加入20ml 1×T BE电泳缓冲液中，微波炉加热使琼脂糖溶解均匀。

(3) 点入 EB (10mg/ml)。

(4) 将凝胶溶液轻轻倒入电泳凝胶板上，除去气泡。

(5) 待凝胶凝固后，小心取出点样梳。

(6) 在电泳槽中加入1×T BE 电泳缓冲液，将胶板放入电泳槽中（点样孔一端靠近电泳槽的负极），使电泳缓冲液没过胶面。

(7) 待测样品中加入1/6体积的6×上样缓冲液，混合后，移液枪点样，记录样品点样顺序及样量。

(8 连接电泳槽与电泳仪之间的电源线，正极为红色，负极为黑色。

(9) 开启电源，开始电泳，最高电压不超过5V/cm。

(10) 当指示剂跑过胶板的2/3，可终止电泳；切断电源后，将电泳凝胶块放在凝胶成像仪中观察，拍照RNA浓度=（OD260-OD320）×稀释倍数×0.04 μg/μl。

TBE的配方：5xTBE buffer (1000ml) 配方：54.0g Tris， 27.5g硼酸， 20ml 0.5mol/l EDTA（ph8.o） 4℃保存用时10倍稀释0.5M EDTA(ph 8.0) (1000ml）配方：1.称取186,1g Na2EDTA.2H2O置于1L烧杯中2.加入800ml的去离子水，充分搅拌3.用NaoH调节ph至8.0（约20g）4.加去离子水定容至1L5.适量分成小分后，高温高压灭菌6.室温保存2.反转录1. 按下列组份配制RT反应液（反应液配制请在冰上进行）5×PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) 2ul 2ul RNA50pg-500ng500-1000ngRNase Free dH2O 补足10ul 补足20UL * 反应体系可按需求相应放大，10 μl反应体系可最大使用500 ng的Total RNA。

因为在25 μlPCR反应液中建议使用相当于10 pg～100 ng Total RNA量的cDNA为模板。

反转录反应液的加入量不能超过PCR 反应液总体积的10%，在25ul的pcr反应体系中加入的cCDNA为2ul，因此10ul的反转录体系中应该保证50pg-500ng的RNA2. 轻柔混匀后进行反转录反应，条件如下:37℃15 min（反转录反应）85℃5 sec（反转录酶的失活反应）4℃3.PCR这些试剂是我们从咱实验室搜集整理配成的一套试剂，现在市场已无实验室批号的试剂1、配制25ul或50ul的反应体系：25 50①cDNA 2ul 4ul②dNTP Mixture（各2.5mM） 4ul 8ul③上、下游引物1:1混合 1ul 2ul④10*LA ＰＣＲBufferⅡ（Mg2+ Plus） 2.5ul 5ul⑤TakaRa LA Taq（5u/ul） 0.25ul 0.5ul⑥DEPC 水（或压过的dd水） 15.25ul 30.5ul2、PCR反应条件①95℃ 5min②94℃ 30秒②③④*32cycles③55℃ 30秒④72℃ 1min⑤72℃ 10min⑥4℃ 59min。

注：引物储存液100uM，工作液上下游1:1混合，浓度均为10uM建议在25 μl反应液中使用相当于10 pg～100 ng Total RNA量的cDNA为模板。

反转录反应液的加入量不能超过PCR反应液总体积的10%。

跑胶操作1、琼脂糖凝胶的制备以稀释的电泳缓冲液（0.5×TBE 溶液）为溶剂，用微波炉配制一定浓度的溶胶。

将胶槽两端分别用透明胶紧密封住。

将胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm 左右的间隙。

待溶胶冷却至50℃左右时，加入最终浓度为0.5 微克/毫升的EB，摇匀，灌入水平胶框，插入梳子，自然冷却，撕去两端的透明胶，拨出梳子；将凝胶放入电泳槽内，加入电泳缓冲液，使电泳缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面。

2、样品配制与加样取适量扩增产物样品，用电泳缓冲液稀释样品，加1/6 体积的6×溴酚蓝指示剂，混均后，点样，记录样品次序与点样量。

3、电泳打开电泳仪的电源开关。

最高电压不超过5V/cm，当琼脂糖浓度低于0.5%，为增加凝胶硬度，可在4℃进行电泳。

琼脂糖凝胶分离大分子核酸实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电压下，分离效果较好。

4、观察和拍照在紫外透射仪下观察DNA 条带，用拍照，或用凝胶成像系统输出照片。

通过比较样品与一系列标准样品的荧光强度，可估算出待测样品的浓度。

5、注意事项与提示1）溴化乙啶具有强烈的致癌作用，操作时应带手套，应避免污染实验高压台面。

2）溴化乙啶在紫外光源上放置时间过长，荧光将会猝灭。

3) 紫外线对人体有损害，对眼睛尤甚，操作时应注意有效防护。

以1.5%的为例1、DNA胶用1.5%的，即300mg 琼脂糖， 20ml 0.5*TBE2、上样体系①扩增产物 7-12ul②上样buffer（6*的溴酚蓝） 2ul③4ul dd水电泳条件：U:120V（恒压跑）I：60mAT：40-50min当溴酚蓝跑到胶的2/3处，即可停止电泳注：退火温度，循环次数5xTBE buffer (1000ml) 配方：54.0g Tris， 27.5g硼酸， 20ml 0.5mol/l EDTA（ph8.o） 4℃保存用时10倍稀释0.5M EDTA(ph 8.0) (1000ml）配方：7.称取186,1g Na2EDTA.2H2O置于1L烧杯中8.加入800ml的去离子水，充分搅拌9.用NaoH调节ph至8.0（约20g）10.加去离子水定容至1L11.适量分成小分后，高温高压灭菌12.室温保存。