美国药典USP31-NF26无菌检查法《71》.doc71 STERILITY TESTS 无菌检查法此通则的各部分已经与欧洲药典和/或日本药典的对应部分做了协调。

不一致的部分用符号（）来标明。

下面这些步骤适用于测定是否某个用于无菌用途的药品是否符合其具体的各论中关于无菌检查的要求。

只要其性质许可，这些药品将使用供试产品无菌检查法项下的膜过滤法来检测。

如果膜过滤技术是不适合的，则使用在供试产品无菌检查法项下的培养基直接接种法。

除了具有标记为无菌通道的设备之外，所有的设备均须使用培养基直接接种法进行检测。

在结果的观测与理解项下包含了复验的规定。

由于无菌检查法是一个非常精确的程序，在此过程中程序的无菌状态必须得到确保以实现对结果的正确理解，因此人员经过适当的培训并取得资质是非常重要的。

无菌检查在无菌条件下进行。

为了实现这样的条件，试验环境必须调整到适合进行无菌检查的方式。

为避免污染而采取的特定预防措施应不会对任何试图在检查中发现的微生物产生影响。

通过在工作区域作适当取样并进行适当控制，来定期监测进行此试验的工作条件。

这些药典规定程序自身的设计不能确保一批产品无菌或已经灭菌。

这主要是通过灭菌工艺或者无菌操作程序的验证来完成。

当通过适当的药典方法获得了某物品中微生物污染的证据，这样获得的结果是该物品未能达到无菌检验要求的结论性证据，即便使用替代程序得到了不同的结果也无法否定此结果。

如要获得关于无菌检验的其他信息，见药品的灭菌和无菌保证<1211>按照下面描述的方法配制实验用培养基；或者使用脱水培养基，只要根据其制造商或者分销商说明进行恢复之后，其能够符合好氧菌、厌氧菌、霉菌生长促进试验的要求即可。

使用经过验证的工艺对培养基进行灭菌操作。

下面的培养基已经被证实适合进行无菌检查。

巯基醋酸盐液体培养基主要用于厌氧菌的培养。

但其也用于检测好氧菌。

大豆酪蛋白消化物培养基适合于培养霉菌和好氧菌。

Fluid Thioglycollate Medium 巯基醋酸盐液体培养基将L-胱氨酸、氯化钠、葡萄糖、酵母提取物、酪蛋白胰酶消化物与纯净水混合，并加热至实现溶解。

将巯基乙酸钠或者巯基乙酸溶解于该溶液，如果需要可再加入1N氢氧化钠，以便在灭菌后该溶液呈pH值7.1 ± 0.2。

如需要则过滤，再次加热该溶液但不得煮沸，并趁热以湿润滤纸将该溶液过滤。

加入刃天青钠溶液，混匀，并将该培养基置于适当容器中，该容器应为培养基提供特定的面积－深度比，以使在培养期末表明氧气摄入的变色部分不超过培养基的上半部分。

使用经过验证的工艺进行灭菌。

如果需要储存该培养基，将其置于无菌、气密容器中，在2 至25 之间储藏。

如果超过上部三分之一的培养基已经呈粉色，可以用以下方法恢复该培养基一次：在水浴锅中或者自由流动蒸气中加热该容器，直至粉色消失，并迅速放凉，须小心防止非无菌空气进入到容器中。

巯基醋酸盐液体培养基将在32.5 ± 2.5 条件下进行培养。

Alternative Thioglycollate Medium 替代巯基醋酸盐培养基配制与巯基醋酸盐液体培养基成分相同，但省略了琼脂和刃天青钠溶液的混合物，按上述方法灭菌，并在使用前静置至凉。

灭菌后pH值为7.1 ± 0.2。

在厌氧条件下培养，培养时间同培养期。

替代性巯基醋酸盐培养基将在32.5 ± 2.5 条件下进行培养。

Soybean–Casein Digest Medium 大豆-酪蛋白消化物培养基将固体物质溶解于纯净水，轻微加热以实现溶解。

放凉溶液至室温，并用1N氢氧化钠调整pH值，以便在灭菌后其pH值呈7.3 ± 0.2。

过滤，如需要则使之澄清，分装入适合的容器，并用经过验证的程序消毒。

如果不立刻使用，则在2 到25 之间以无菌且密闭良好的容器保存。

.大豆-酪蛋白消化物培养基将在22.5 ± 2.5 条件下培养。

Media for Penicillins or Cephalosporins 用于青霉素和头孢菌素的培养基当无菌检查培养基用于供试产品无菌检查项下的培养基直接接种法时，按如下内容变更巯基醋酸盐液体培养基和大豆-酪蛋白消化物培养基的制备方法。

向每一种培养基的容器中，以无菌操作转移足够灭活供试样品中所存在抗生素的-内酰胺酶。

使用此前已经对其青霉素或头孢菌素灭活能力进行了测定的-内酰胺酶配制品，来测定灭活该抗生素所必需的-内酰胺酶数量。

[注意：补充的-内酰胺酶培养基也可以用于膜过滤试验]或者（在与无菌试验所用场所彻底隔离的区域中），按照验证试验项下的任意一种方法，使用少于100个菌落（cfu）的金黄色葡萄球菌（见表1）作为验证菌，来确认适当数量的-内酰胺酶已经被整合到该培养基中。

必须观测到接种后培养物中出现典型微生物生长，才能确认-内酰胺酶浓度是适当的。

表1 适合用于生长促进试验和验证试验中的试验微生物的菌株Suitability Tests 适合性试验.所使用的培养基须符合下列试验，这些试验应在检验供试产品之前或者同时进行。

STERILITY 无菌状态通过在指定培养温度下将一部分培养基培养14天，来确认每一批已灭菌培养基的无菌状态。

不得出现微生物生长。

GROWTH PROMOTION TEST OF AEROBES, ANAEROBES, and FUNGI好氧菌、厌氧菌、霉菌的生长促进试验检查每一批已经配制好的培养基和每一批用脱水培养基或配料制备的培养基1。

适当微生物菌株见表1。

在部分巯基醋酸盐液体培养基上接种少量（不超过100cfu）下列微生物，每一种微生物均使用单独一部分培养基：产芽胞梭状芽胞杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌。

在部分替代巯基醋酸盐液体培养基上接种少量（不超过100cfu）产芽胞梭状芽胞杆菌。

在部分大豆-酪蛋白消化物培养基上接种少量（不超过100cfu）下列微生物，每一种微生物均使用单独一部分的培养基：黑曲霉、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌。

细菌培养时间不超过3天，霉菌培养时间不超过5天。

如果出现清晰可见的微生物生长，则该培养基是适合的。

STORAGE 保存如果配制好的培养基保存于未密闭的容器中，只要在使用时间的2周内对其进行了生长促进试验并且符合颜色指示剂的要求，它们就可以使用1个月。

如果保存在密闭的容器中，只要在使用时间的3个月内对其进行了生长促进试验并且符合颜色指示剂的要求，则该培养基可以使用1年。

用于膜过滤的稀释和冲洗液Fluid A 液体APREPARATION 配制品将1g动物组织胃蛋白酶消化物溶于1L水中，如果需要则通过滤或离心使其澄清，再调节pH值至7.1 ± 0.2。

分装入容器中，并用经过验证的工艺灭菌。

PREPARATION FOR PENICILLINS OR CEPHALOSPORINS用于青霉素或头孢菌素的配制品在供试样品溶液已经过滤（见用于青霉素或头孢菌素的培养基）之后，如果需要，向上述配制品中，以无菌操作加入数量足够灭活滤膜上残余抗生素活性的-内酰胺酶。

Fluid D 液体D向每升液体A中，加入1mL聚山梨酯80，调节pH值至7.1 ± 0.2，分装入容器中，并使用经过验证的工艺灭菌。

此液体用于含有卵磷脂或油脂的物品，或用于标为“无菌通道”的设备。

Fluid K 液体K将5.0g动物组织胃蛋白酶消化物、3.0g牛肉提取物、10.0g聚山梨酯80溶解于1L水中。

调节pH值，以便使pH值在灭菌后呈6.9 ± 0.2。

分装入容器中，并使用经过验证的工艺灭菌。

VALIDATION TEST验证试验按照下面供试产品无菌检查项下的描述，使用除了下面变更之外完全相同的方法，进行试验。

Membrane Filtration 膜过滤.在将一个或多个供试容器中的内容物转移到滤膜之后，在最后一次的冲洗液中加入少量（不超过100cfu）试验菌.Direct Inoculation 直接接种在将一个或多个供试容器（对于兽医的肠线和其他外科缝合用线：若干股线）中的内容物转移至培养基之后，将少量试验菌（不超过100cfu）加入至培养基中。

在这两种情况中，均按照上述好氧菌、厌氧菌、霉菌生长促进试验项下的描述，使用同样的微生物。

进行一个生长促进试验作为阳性对照。

培养所有含有培养基的容器，培养时间不超过5天。

如果在培养后得到清晰可见的微生物生长，看起来与没有产品的对照容器中的生长类似，则该产品在此试验条件下没有任何抗微生物活性，或者此活性已经被令人满意地消除了。

然后，无菌试验可以进行，而无需进一步的变更。

如果用肉眼与没有产品的对照容器比较，无法在存在供试产品的情况下得到清晰可见的生长，则该产品在试验条件下所具有的抗微生物活性尚未令人满意地消除。

变更条件以便消除抗微生物活性，并重复验证试验。

当(a)一个新产品必须进行无菌试验时，和(b)无论何时该试验的试验条件发生改变时，则需进行此验证试验。

该验证可以与供试产品的无菌试验同时进行。

TEST FOR STERILITY OF THE PRODUCT TO BE EXAMINED供试产品的无菌检查Number of Articles to Be Tested 供试物品数量除非在此章节的其他位置或在具体的各论中另有规定，供试物品的数量遵照表3中的规定。

如果每个物品的内容物有足够数量（见表2），可以将其分成若干等份，将适当的等份加入到每个指定的培养基。

[注意：使用两个或更多指定培养基，来进行无菌试验。

]如果每个物品内容物的数量不够每个培养基的用量，使用表3中所规定物品数量的2倍。

Table 2. Minimum Quantity to be Used for Each Medium表2：用于每个培养基的最小数量Table 3. Minimum Number of Articles to be Tested in Relation to the Number of Articles in the Batch 表3：与物品批量相关的最小供试物品数量此试验可以使用膜过滤法或培养基直接接种法进行。

应包括多个适当的阴性对照。

只要该产品的性质许可，就应使用膜过滤法；这些性质是，可过滤的水溶性配制品、酒精或油性配制品、易混合或溶解于水或油性溶剂的配制品，只要这些溶剂在试验条件下没有抗生素效果。

Membrane Filtration 膜过滤使用标称孔径不大于0.45 µm的膜过滤器，此孔径已知能够有效截留微生物。

例如，硝酸纤维素过滤器可用于水、油、稀醇溶液；而醋酸纤维素可用于浓醇溶液。

特定产品（例如，抗生素）可能需要特别改造过的过滤器。

下面描述的方法所使用直径约50mm的滤膜。

如果使用不同直径的过滤器，稀释液和洗液的体积应当作相应调节。