半胱氨酸与卵母细胞成熟
• 改良的 TCM199 主要是在 TCM199 中添加了 PVA 葡萄糖 丙酮酸钠和半 胱氨酸， 这其中主要起作用的是半胱氨酸，半胱氨酸是谷胱甘肽的组 成成分， 谷胱甘肽在细胞生长 氨基酸转移及 DNA 和蛋白质合成中起 到重要作用， 此外还可以减轻氧压力， 起到抗氧化的作用 • 谷胱甘肽 ( g l u tathione , GS H ) 是一种具有重要生理功能的三肽硫醇, 由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成。GSH在哺乳动物细胞中发挥着重 要的生物学作用, 参与卵母细胞的成熟[ 2]。而半胱氨酸是GSH的前体 物质, 在牛卵母细胞 I VM 时, 疏基复合物能增加细胞内的 GS H的浓度, 并保持 GS H高浓度状态, 从而提高胚胎的发育率[ 3]。 • 工作浓度0.1mg/ml • 有研究证实, 高浓度的半胱氨酸 ( 1.14 mmo l/L) 在成熟培养全过程 ( 42 h) 中能显著影响囊胚发育[ 7], 用含半胱氨酸的培养液培养猪的卵母细 胞, 可提高猪卵母细胞的成熟率, 也可提高体外受精后的雄原核的形成 率。并且, GS H 参与被氧化物质的还原反应, 防止脂质过氧化, 并以高 浓度的形式分布在细胞核和线粒体的周围, 保护 DNA 免受氧化反应引 起的损伤,有利于早期胚胎细胞克服发育阻滞和进行正常的生长发育 [ 3]。
在哺乳动物卵母细胞内，Plk1 和 Akt 诱导的 MPF 激活在 GVBD 事件中 起重要作用。MPF活性能被通过 Cdc25B 和 WeelB 通路的 PKC 和 cAMP 依赖的 PKA 抑制，这个机制不依赖于卵内 MAPK 激活，但卵内 MAPK 的人工激活能诱导 MPF 激活并引起 GVBD。相反地，卵泡颗粒细胞内 MAPK 的激活对于促性腺素诱导的减数分裂恢复是必需的。促性腺素 诱导的颗粒细胞内 GPR 的激活引起 p38MAPK 和 cAMP 依赖的 PKA 的 激活，这些路径的激活促进前体EGF 家族成员的表达。当这些家族成 员前体形式被金属蛋白酶所裂解后，成熟的 EGF 家族成员诱导颗粒/ 卵丘细胞内 EGFR 的激活，并通过一个为证明的路径激活 MAPK。FSH 刺激定位在卵丘细胞膜上的 FSH 受体，并通过 PKC 和 cAMP 依赖的 PKA 通路激活 MAPK。颗粒/卵丘细胞内激活的 MAPK 的可能的作用是 促进 MAS 的表达，通过间隙连接从卵丘细胞转运到和卵母细胞，引 起 MPF 激活。另一个可能的作用是刺激类固醇的合成，类固醇与定 位在卵上的受体结合，引起卵内 MAPK 激活。颗粒/卵丘细胞内 MAPK 的激活也能引起颗粒/卵丘细胞和卵母细胞内 CX37 和 CX43 的灭活， 并中止了 cAMP 从体细胞到卵母细胞的转移。所有这些事件诱导哺乳 动物卵母细胞内减数分裂的重新起始。
卵丘细胞包被 卵丘细胞质量是影响卵母细胞体外成熟的重要因素之 一。卵母细胞所需的营养物质依赖卵丘细胞提供，两 者间还通过缝隙连接进行信号传导，进而调节卵母细 胞的生长和成熟。裸卵仅能够利用周围介质中的丙酮 酸和三羧酸循环的中间产物，不能直接利用葡萄糖。 卵丘细胞可将葡萄糖转化为丙酮酸，为卵母细胞的生 长和发育提供能量。如果两者间缝隙连接被过早破坏， 卵母细胞可能停止发育（郑行，1994）。卵丘细胞在 卵母细胞离体后至受精前的成熟培养期间里对卵母细 胞自身的成熟起着很大作用，从而影响到随后的受精 及卵裂过程，而这个作用是随着卵丘细胞层数的增加 而提高（杨膺白等，1994）。FSH、LH 通过作用于卵 丘细胞上的受体，传递信号或分泌活性物质，作用于 卵母细胞，调节卵母细胞发育（Byskov 等，1997）。 说明卵丘细胞包裹对于卵母细胞体外成熟有积极作用。
培养时间
• 哺乳动物卵母细胞体外成熟培养时间通常 是22～24 h。但猪比较特殊，通常需要44～ 48 h左右能达到核成熟，24 h时的核成熟率 几乎为零。虽然延长培养时间可以使核成 熟率逐步增高,但猪的卵母细胞会逐渐老化。 因此，在保证一定的核成熟率的前提下， 有必要缩短猪卵母细胞体外成熟培养时间。
卵母细胞体外成熟的调节机制 卵母细胞的成熟期是指从减数分裂的前期开始到第二次减数分裂 中期为止的这一时期。在此期间，有三个生化因子表现最为活跃， 它们是成熟促进因子（maturation promoting factor，MPF）、细胞 静止因子（cytostatic factor，CSF）、卵母细胞成熟抑制因子 （oocyte maturation inhibitor，OMI）。MPF 催化一些与细胞分裂 有关的蛋白质发生磷酸化，促使细胞由间期向 M期转化，CSF M 期状态，OIM 主 要抑制卵母细胞的成熟分裂。由此可见，MPF 是卵母细胞成熟的 中心调控物质，而 CSF 起正调控，OIM 起负调控，它们协同调控 卵母细胞成熟的正常进行。另外还有一些分子参与卵母细胞的成 熟，如 cAMP、激素、细胞因子和粘多糖等。卵丘细胞包裹的层数， 被作为卵母细胞评定的一个指标。因为一些受体在卵丘细胞和卵 母细胞上的分布不同，所以在卵母细胞体外成熟过程中需要卵丘 细胞的参与。例如一些激素 FSH、LH，还有一些生长因子 EGF 等 等，它们的作用要通过卵丘细胞来实现。卵母细胞体外成熟的调 节机制卵母细胞的成熟期是指从减数分裂的前期开始到第二次减 数分裂中期为止的这一时期。
卵泡液与卵母细胞成熟
• 卵泡液是卵母细胞体内发育的介质，含有大量来 自血清的生化因子和卵母细胞及卵泡细胞的分泌 因子，对卵母细胞成熟具有重要调节作用。主要 表现在提高卵母细胞质成熟的质量，增强胚胎的 发育能力。并且，在体外条件下，pFF能有效降低 猪卵母细胞染色体异常的发生率，调解和加速极 体排出，使核质成熟趋于同步化。但添加过高则 抑制卵母细胞核成熟(Yoshida 等)，成熟液中添加 10%pFF可促进猪卵母细胞在体外的核成熟。控制 其浓度，一方面消除了对核成熟的抑制作用，另 一方面又突出了对胞质成熟的促进作用。
卵母细胞的分级
• 包裹在卵母细胞周围的卵丘细胞的层数也影响着卵母细胞 的体外成熟。不同的研究者对卵母细胞的分类不尽一致。 根据卵母细胞外卵丘细胞的有无和层数，猪卵丘-卵母细 胞复合体分5级[5]。A级：扩展且颜色较暗，卵丘细胞有5 层以上包裹的胞质均匀的卵母细胞；B级：卵丘细胞颜色 较浅且稀疏的，卵丘细胞有5层以上包裹的胞质均匀的卵 母细胞；C级：有3～5层卵丘细胞紧密包裹的均匀胞质卵 母细胞；D级：卵丘细胞稀少，胞质不均匀；E级：裸卵、 黑卵。A、B级可以用于体外成熟培养，一般成熟率较高， 而C、D级则效果较差，E级不能用于体外培养。
EGF与卵母细胞成熟
• 在猪的卵母细胞体外成熟培养中，研究较多的就 是表皮生长因子(EGF)。EGF是一种卵母细胞成熟 的诱导剂，能促进COCs的体外成熟，在COCs上存 在EGF受体，随着卵泡的发育表达增强，排卵前达 到高峰[8]。EGF能够诱导猪[9]、牛[10]体外培养卵 子的卵丘扩散，并促进核成熟。EGF能促进卵母细 胞成熟过程中蛋白质的合成，提高卵母细胞质的 成熟质量，添加EGF培养成熟的卵母细胞受精后的 发育能力更强[11]。另有研究报道，EGF对猪雌性 原核形成有促进作用，EGF不但能促进卵母细胞减 数分裂，也间接调节卵母细胞浆的成熟。
在卵母细胞的体外成熟过程中，卵母细胞成熟率和成熟的 质量，取决于卵丘细胞的数量和质量。在卵母细胞体外成 熟研究中，一般根据卵丘细胞的数量和扩张的程度分为 4 种类型：即包绕 3 层以上紧密卵丘细胞的卵母细胞为第 1 类；3 层以下的为第 2 类；卵丘细胞扩展而疏松，卵母细 胞卵质无斑块的为第 3 类；无卵丘细胞的卵母细胞（裸卵） 为第 4 类。李丽立等（2002）对这 4 类卵母细胞体外成熟 研究结果表明，达到 MII 期的成熟率分别为 93%、90%、 76%、20%，成熟效果依次递减。因为在哺乳动物卵母细 胞成熟研究中发现，处于静止期的初级卵母细胞在激素的 作用下，若没有卵丘细胞的存在则卵母细胞不能成熟。可 见在卵母细胞成熟发育时卵丘细胞直接向卵母细胞发出成 熟发育信息。卵丘细胞对卵母细胞有着重要的协同作用， 所以卵丘的完整性和卵丘细胞包绕情况对卵母细胞成熟具 有重要的作用。因此，在进行猪胚胎体外生产时多选择卵 母细胞胞质均匀、透明带完整、具有 3 层或 3 层以上卵丘 细胞的 COCs 进行培养。
卵泡大小 不同卵巢上的卵泡大小不一样，同一卵巢上的卵泡大小也不 同。一般取直径为 3~6mm的为宜，其质量较好，卵丘细胞形 态好的较多，整体大小比较均匀，核成熟率为 40.8%。哺乳 动物大腔卵泡的卵母细胞、小腔卵泡的卵母细胞和原始卵泡 都能完成体外成熟和体外受精，但卵泡的大小对卵母细胞的 成熟和发育有重要影响。猪卵泡直径直接影响卵母细胞体外 成熟率，成熟率较高的卵母细胞是来自中等直径的卵泡，而 小卵泡中的卵母细胞成熟率明显下降。来自大卵泡的卵母细 胞在体外培养时退化严重（王海，2002）。孟庆刚等（2001） 研究了由2mm 以下猪卵泡获得的小、中、大三类卵母细胞， 培养 48h 的成熟率分别为 0、22.31%和45.45%。2mm 以下卵 泡卵母细胞的成熟率（52.63%）显著低于 2~6mm 卵泡卵母 细胞的成熟率（80.39%）猪卵泡直径只有达到 2mm 以上， 其卵母细胞才具备体外成熟的能力，小腔卵泡中的卵母细胞 缺乏进一步发育所需的关系因子，大卵泡中卵母细胞的退化 可能与其过早成熟而发生老化有关。
卵母细胞采集方法 卵母细胞的采集方法有抽吸法和切剖法。在从离体卵巢上采 集卵母细胞时，因采集方法不同，所得卵母细胞体外成熟率 间存在一定的差异，如抽吸法成熟率（77.6%）低于切剖法 （80.4%）。抽吸法和切剖法相比两者各有优缺点。与抽吸 法相比，切剖法虽然费时，但极少破坏卵丘卵母细胞复合体 （COCs），这种采集方法更有利于 COCs 的生长发育（陈晓 宇等，2002）。注射器抽取有腔卵泡要比用刀片割破所取卵 母细胞的数目要少，但是符合取卵时间愈短愈好的原则，因 其方便、干净、简捷而被普遍使用。但要注意选择合适的注 射器和针头。通常 10mL 注射器加18 号针头是比较合适的。 实践发现 10mL 注射器实用操作性比5 和 20mL 的好，抽取卵泡的速度也比较快，特别是针头的大小非常重 要。针头太大，卵母细胞流失很多，没有足够数量的卵母细 胞进行实验；针头太小则抽取过程中卵丘细胞会大量的脱落， 因为卵丘细胞对卵母细胞有重要的协同作用，卵丘细胞的脱 落将不利于卵母细胞的体外成熟。