光电物理基础课程设计自旋在现代科学中的应用教师：蒋向东学生：骆骏学号：20100510600232012.6.9一．摘要电子自旋共振(electronspinresonance，ESR)是检测自由基最直接最有效的方法，是自由生物学和医学不可缺少的重要研究技术。

本文综述ESR、自旋标记、自旋捕集ESR成像技术的最新发展及ESR技术在细胞膜、蛋白质结构和一些重大疾病如心脏病、老年痴呆症、帕金森综合症和中风等疾病研究及辐射损伤和植物疾病研究中的应用。

二．电子自旋共振(ESR)技术电子自旋共振(electronspinresonance，ESR)又称电子顺磁共振(electronparamag—neticresonance，EPR)，是研究电子自旋能级跃迁的一门学科，是检测自由基最直接最有效的方法。

自由基在生物体系发挥着重要作用，体内自由基的产生和清除应当是平衡的，或者说体内氧化和还原应当是平衡的，这样人体才能保持健康。

如果自由基产生过多和清除自由基的能力下降，体内就会有多余的自由基，特别是氧自由基，会损伤细胞成分，但并不出现疾病的症状。

但是如果不加以调整，继续发展下去就会导致疾病和衰老的发生。

因此自由基和多种疾病有关，比如癌症、心脑血管疾病、老年痴呆症和帕金森综合症等疾病。

这样ESR 就是自由基生物学和医学不可缺少的重要研究技术，在生物会医学领域有着广泛的应用。

1.ESR在生物医学研究中的技术发展ESR虽然是研究自由基的最直接和最有效的技术，但是这些自由基必须是相稳定的，而且要达到一定浓度才能用ESR技术检测和研究。

而生物体系中产生的自由基大部分是不稳定的，因为自由基本身的特点就是活泼和反应性强，只有少数自由基是稳定的。

ESR的另外一个局限性是只能检测顺磁性物质，但是大部分生物物质都不是顺磁性的。

这就限制了ESR 的应用。

为了克服ESR技术的这些局限性，一方面对仪器进行改进，另一方面近年来发展起来的自旋标记和自旋捕集技术解决了这些问题，为ESR应用开辟了一个新天地，获得了迅速的发展和广泛的应用，也为自由基研究作出了重要贡献。

1.1．自旋标记技术ESR的最大局限性是只能检测顺磁性物质，但是大部分生物物质，例如细胞膜、蛋白质、核酸等都不是顺磁性的。

这就大大限制了ESR 的应用范围。

1965年McConnell等人引入自旋标记的概念和方法，为ESR应用开辟了一个新天地，也可以说自旋标记技术把ESR 的应用范围从一个有限范围扩展到了无限。

所谓自旋标记，就是将一顺磁性报告基团加到被研究体系，借助报告基团的ESR波谱特征反映该基团周围环境的物理和化学性质及其变化和规律。

自旋标记技术包括自旋标记物的合成、自旋标记ESR波谱解析和应用。

到目前为止已经合成100多种自旋标记物。

现在自旋标记技术已经广泛应用于生物学的各个领域，特别是在细胞膜的流动性、蛋白质的结构和动力学性质、药理学及ESR成像方面研究中的应用。

1.1.1．自旋标记物的选择自旋标记物应当符合以下条件：足够稳定，能够以某种方式结合或嵌入到被研究物质的某个位置，其ESR波谱对被研究物质及其周围环境的物理化学性质和变化极为敏感，而报告基团本身对体系的扰动甚微。

氮氧自由基化合物是最符合以上条件的自旋标记物，它有几个共同的特点，一是都有氮氧自由基，在氮氧之间有一个未成对电子，这是报告基团，可以用ESR检测到ESR信号；二是在氮氧自由基周围都有2～4个甲基，这些甲基像保护伞一样为未成对电子提供了一个空间保护屏障，使得氮氧自由基保持长期稳定；三是都有一个功能基团R，这个R基团可以是能与其他物质共价结合活性基团，就是自旋标记物，也可以是不与其他物质共价结合活性基团，而仅仅是与被研究物质非共价结合的，就是自旋探针。

1.1.2．自旋标记的波谱特征氮氧自由基自旋标记的波谱比较简单，一般都是三线谱，在不同环境其线形和线宽发生变化。

在溶液中的波谱为各向同性的波谱，可以得到3条等强度的共振谱。

在单晶中，改变单晶和外磁场的相对取向，就可以得到不同ESR波谱。

自旋标记物在轴对称体系，例如细胞膜，其ESR波谱就是轴对称的。

自旋标记物被紧紧地固定在一个位置不能自由运动就会出现强固定化波谱，如结合在蛋白质上就是这种情况，其ESR波谱明显加宽和不对称。

一些紧紧结合在蛋白质的狭小活性位置内的自旋标记也给出这种波谱。

如果自旋标记物还可以做某些运动这时就给出弱固定化波谱，有时会出现2种波谱同时存在的情况。

1.2．自旋捕集技术ESR是研究自由基的最直接和最有效的方法和技术，但是这些自由基必须是相对稳定的，而且要达到一定浓度才能用ESR技术检测和研究。

而生物体系和化学反应中产生的自由基大部分是不稳定的，因为自由基本身的特点就是活泼和反应性强，只有少数自由基是稳定的。

如羟基自由基的寿命大约为10^（-6）S，这是常规ESR波谱仪无法检测的。

为了克服ESR 技术的这一局限性，发展了自旋捕集技术，是目前研究生物和医学体系中活泼自由基应用最多也是最成功的一种方法，每年都有大量文献报道。

所谓自旋捕集技术就是为了检测和辩认短寿命自由基，将一种不饱合的抗磁性物质(称自旋捕集剂，一般为氮酮和亚硝基化合物)，加入要研究的反应体系，生成寿命较长的自旋加合物，可以用ESR检测。

现在已经合成上百种自旋捕集剂，最常用的自旋捕集剂有tNB (nitroso—tert—bu—tane)，DMPO (5，5-dimethyl1一pyrroline1一oxide)，PBN (phenyl—tert—butynitrone)，它们和自由基反应都可以生成氮氧自由基，所得ESR波谱的一级分裂都是氮原子引起的三重分裂，这一点和自旋标记所得到的ESR波谱很类似。

但是自旋加合物的ESR波谱常常被分裂为二、三级更复杂的图谱，由二、三级分裂峰值的数目和强度可以推导出捕捉到自由基的结构和性质。

1.2.1．氧自由基的捕捉超氧阴离子自由基不仅具有重要的生物功能和与多种疾病有密切联系，而且它还是所有氧自由基中的第一个自由基，可以经过一系列反应生成其它氧自由基，因此具有特别重要的生物功能和意义。

羟基自由基是已知的最强的氧化剂，它比高锰酸钾和重铬酸钾的氧化性还强，是氧气的三电子还原产物，反应性极强，几乎可以和所有细胞成分发生反应，对机体危害极大。

DMPO是一种对氧自由基捕集效率很高的自旋捕集剂，而且形成的自旋加合物，DMPO —OH，DMPO—OOH，有很特征的超精细分裂图谱和超精细分裂常数。

DMPO—OH的ESR 波谱由4条谱线组成，强度比为1：2：2：1，这是由于N的超精细分裂常数等于H的超精细分裂常数的结果(an=ah=1．49mT)，是用ESR技术判别羟基自由基的重要标志。

超氧阴离子自由基DMPO 自旋加合物的典型ESR波谱，DMPO—OOH的ESR波谱是由4组12条谱线组成的，其中an=1．43mT，ah=1．17mT，ah=0．125mT。

这类ESR波谱常被人们用来检验一个体系是否有超氧阴离子自由基产生的判据。

DMPO自旋加合物不稳定，很难用于体内氧自由基检测，针对这一缺点，人们又合成了一系列新的自旋捕集剂，比较成功的有5一(Diethoxyphosphory1)一5f_methyl一1一pyrro—lineN—oxide(DEPMPO)；5-tert utoxycarbony15-methyl一1pyrrolineN—oxide(BMPO)和5一ethoxycarbony卜5一methyl一1一pyrrolineN—oxide(EM'PO)。

1.2.2．脂类自由基捕集脂质过氧化是一个产生自由基和自由基参与的链式反应。

过去人们研究脂质过氧化一般都采用总胆汁酶(TBA)法检测脂质过氧化产生的最终产物之一丙二醛(MDA)，这样很难深入研究脂质过氧化的自由基机理。

利用4-POBN自旋捕集剂在亚油酸，脂质体微粒体，突触体和红细胞膜等体系中捕捉到了脂质过氧化产生的脂类自由基，研究了它们产生的机理及天然抗氧化剂对脂类自由基的清除作用机理。

1.2.3．单线态氧的捕集利用叔胺四甲基哌啶(TEMPONE)可以特异地检测单线态氧，是3条等强度的ESR谱线组成的。

为了证明体系中确实有单线态氧产生，往往还需要单线态氧的清除剂β一胡萝卜素证明另外。

四甲基乙烯(TME)，2，二甲基呋喃(DMF)，9，10一二苯基蒽(DPA)等也可以淬灭单线态氧，用以证实单线态氧的存在。

单线态氧在D2O中的寿命要比在H2O中长10～15数量级，这也是鉴别单线态氧存在的一个重要方法。

若在反应体系中加入D2O，用ESR检测单线态氧产率增大，进一步证明体系中确实有单线态氧产生。

1.2.4．NO自由基的检测NO是内皮细胞松弛因子，能够松弛血管平滑肌，防止血小板凝聚，是神经传导的逆信使，在学习和记忆过程及免疫和疾病中发挥着重要作用。

NO是自由基，但由于它的自旋和轨道角动量偶合不能用ESR直接检测。

有2种ESR技术可以检测溶液中的NO，一种就是传统的氮氧自由基自旋捕集NO 自由基，另一种是用铁盐络合物。

前者可以和NO反应生成自旋加合物自由基，对化学体系产生的NO 自由基捕集效果很好，但是很难用于细胞和生物体系；后者已经成功地用于检测体内产生的NO自由基了。

我们利用有机溶剂抽提甲苯二氨基甲酸乙酯铁络合物(DETC。

一Fe )成功的检测了组织和培养细胞中产生的一氧化氮自由基，使ESR自旋捕捉一氧化氮自由基的灵敏度提高50～100倍。

1.2.5．一氧化氮和氧自由基的同时检测在生物体内和活细胞中，一氧化氮自由基和超氧阴离子自由基往往是同时产生的。

人们过去一般是分别测定它们的产生和进行研究的，这样就会造成一定误差，同时也不方便。

因此，我们实验室建立了一种利用ESR 自旋捕捉技术，把体内和活细胞中产生的一氧化氮自由基和活性氧自由基(ROS)同时捕捉住并进行检测。

这样就可以既准确又方便地检测和研究体内和活细胞中产生的一氧化氮自由基和活性氧自由基的规律。

1.3．ESR成像技术电子自旋共振成像(ElectronSpinResonanceImaging，ESRI)是基于ESR技术和CT扫描成像技术的一种影像化显示和测量样品中自由基或顺磁物种的分布及其变化过程的无损检测技术。

常规ESR只能测定自由基的的种类和浓度，但是不能测定自由基的空间分布。

ESRI 技术在物理学、化学、半导体学、地质学、考古学、生物学和医学等许多科研领域有着巨大的应用前景，特别是在生物学和医学中的应用价值和潜力更十分引人注目。

研究活细胞和活体组织产生自由基及天然抗氧化剂在细胞和心脏或脑中与NO和氧自由基作用的空间分布和反应动力学，给出体内自由基分布图和各种疾病的关系，这对从整体概念研究自由基在细胞和活体组织损伤作用机理有重要理论意义。