置培养2〜4天，待长出大量抱菌种接种到马铃薯茄子瓶斜面(20%马铃薯煎出汁加MgSO4•7H2O5mg/L，琼 脂2%，pH 6.7〜7.0)，37C培养3天。然后接入到20L种子罐，37C搅拌，通风培养12〜14小 时。此时菌种进入对数生长期(镜检细胞密集，粗壮整齐，大多数细胞单独存在，少数呈链状， 发酵液pH 6.3〜6.8,酶活5〜10U/mL)，再接种到发酵罐。
a淀粉酶的抱子培养基配置如下：将麸皮5%、豆饼粉3%、蛋白胨0.25%、琼脂2%(pH 7.1)制成斜面培养基，在0.1MPa蒸汽灭菌20min。
(3)种子培养基
种子培养基是供抱子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长得粗壮成为活力强的种 子。对于种子培养基的营养要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也比较高些，浓度以稀
2
2.1培养基的制作
(1)培养基的类型
培养基的种类很多，可以根据组成、状态和用途等进行分类，按照用途可以分成抱子培养 基，种子培养基和发酵培养基。微生物大规模发酵设计主要用到抱子，种子和发酵培养基这三 种类型。
(2)抱子培养基
抱子培养基配制的目的是供菌体繁殖抱子的， 常采用的是固体培养基，对这类培养基的要 求是能使菌体生长快速，产生数量多而优质的抱子，并且不会引起菌体变异。对抱子培养基的 要求：①营养不要太丰富；②所用无机盐的浓度要适量；③注意培养基的pH和湿度。
a
摘要：a-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、
低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。目前，a-淀粉酶已广泛应用
于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业。
1•
1.1细菌的分离与初步鉴定：
将土壤系列稀释，把10-3、10-4、10-5分别涂布到淀粉培养基上，27C倒置培养2天，将 长出的菌落接入斜面。将细菌从斜面接种到淀粉培养基培养2天，用碘液染色，记录透明圈大 小和菌落直径，计算D/d值。保菌供下次实验用。
经NTG反复多次处理，a淀粉酶活力有较大幅度提高。在经5次NTG处理之后，其变异 株a淀粉酶活达到34 200(U/ml)，较出发菌株提高了4.2倍以上，说明该诱变处理及选育方法 是行之有效的。经NTG处理所得的变异菌株的产酶稳定性较差，必须经反复多次单菌落分离和 摇瓶比较，逐渐筛选出产酶稳定性好的菌株。
别培养。
8把KI-I2液用喷雾器均匀分布在disc培养皿培养基的表面上，并挑出淀粉水解圈大的
disc，用相对应的1ml培养液接种摇瓶，进行发酵测定酶活力。把各种斜面菌株经活化培养， 接种于1%淀粉培养基的三角瓶中，进行摇瓶比较实验。将菌株作逐一对比，从中筛选出酶活 较高的产酶菌株。经菌种诱变选育a淀粉酶高产菌株为诱变的出发菌株，经NTG反复多次处 理，并经淀粉水解圈初筛和摇瓶复筛，来选育a淀粉酶高产菌株。
面培养基上。
1.3
1诱变出发菌株在完全培养基中培养至对数生长期后期。
2以NTG为诱变剂，按一定处理剂量（包/ml），在一定pH值的缓冲液中30T恒温振荡处
理1~4h0
3经高速离心分离，移植于液体完全培养基进行后培养。
4经稀释涂布在含有1%淀粉BY固体培养基上，经24h培养形成小菌落。
5把单菌落分别移植于含2%淀粉BY液体培养基中，30E培养36ho
1C,罐压0.5kg/cm2,风量1〜20h为1：0.48vvm,20h后1：0.67vvm，培养时间为28〜36h。
2.2耐高温a-淀粉酶的生产方法
耐高温a-淀粉酶生产工艺，采用地衣芽抱杆菌为菌株，通过一级种子罐发酵、大罐发 酵、过滤、成品处理制得。
2.2.1耐高温a-淀粉酶的生产原料
有采用地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)1.5吨种子罐发酵，玉米淀粉6%~10%, 玉米浆1%~3%,豆粕2%~5%，磷酸二氢钾0.3%~0.6%，磷酸氢二钾0.5%~2%,柠檬酸钠0.1%~0.3%,35吨发酵罐发酵，玉米淀粉15%~30%，玉米粉5%~10%,豆粕1%~8%，玉米浆2%~5%，磷酸二氢钾0.1%~0.8%，磷酸氢二钾0.8%~2%,柠檬酸钠0.05%~0.4%等。
6用2#定性滤纸制成5mm disc（小圆纸片），并用2%琼脂BY培养基灭菌后加入较大剂量 青霉素（抑菌）。倒入200mmx300mm长方形不锈钢玻璃培养皿中，冷却凝固。然后把5mm disc纸顺序放在培养基表面。
7用微量注射器分别吸取培养液，移植到相应的disc上。把disc培养皿经37C,24h分
1.2紫外线诱变育种：
取活化后的菌种配成菌悬液、稀释；倒淀粉培养基平板，将菌悬液涂布其表面；用紫外线
处理平板0、2min、4min、6min、8min、10min，每个处理2次重复；放到黑暗中倒置培养，
37C培养48h，分别计数诱变组和对照组平板上的菌落数，并计算致死率；加入碘液，分别测 量诱变组和对照组菌落的透明圈直径和菌落直径，计算D/d值；将D/d值最大的菌种保存到斜
(3)发酵罐培养
培养基的配制：用麦芽糖液配置成含麦芽糖6%、豆粕水解液6%〜7%、
Na2HPO4・12H2O0.8%、(NH4)2SO40.4%、CaCI20.2%、NH4CI0.15%、豆油1kg、深井水20L， 调pH至6.5〜7.0。
发酵罐培养基经消毒灭菌冷却后接入3%〜5%种子培养成熟液。培养条件为：温度37±
a淀粉酶的发酵培养基配方是：麸皮70%、小米糠20%、木薯粉10%、烧碱0.5%,加水使 水量达60%,常压蒸汽灭菌1h.
本发酵属于一级种子罐扩大培养，二级发酵。设计流程如下：抱子一锥形瓶-种子罐-
发酵罐
(1)抱子制备
将保存在淀粉琼脂斜面上的枯草芽抱杆菌抱子用无菌水洗下，接种到锥形瓶中，在35°C静
薄为好，可以达到较高的溶解氧，供大量菌体生长和繁殖。
a淀粉酶的种子培养基的配置：将豆饼1%、蛋白胨和酵母膏各0.4%、氯化钠0.05%配置成
种子培 养基(pH 7.1〜7.2)，在0.1MPa蒸汽灭菌20min。
(4)发酵培养基
发酵培养基的要求是营养要适当丰富和完全适合于菌种的生理特性和要求，使菌种迅速生长、健壮，能在比较短的周期内充分发挥产生菌合成发酵产物的能力，但要注意成本和能耗