精制工艺
生产食品级产品需要进行提取和精制处 理。提取的精制设备是板框压滤机和超 滤器。使用板框压滤机除去发酵液中的 菌体和杂质，得到较纯的酶液滤饼，含 水量要求小于45 %含酶小于100U。将 得到的酶液再进行防腐和调配处理便成 为产品。
二、脂肪酶
• 三酰基甘油基水解酶，可水解三酰甘油 酯为甘油和脂肪酸 • 广泛存在于动植物和微生物内 • 微生物脂肪酶的种类很多，广泛存在于 细菌，酵母和霉菌
（三）发酵方法—固体发酵
固体发酵法以植物秸杆为主要原料，工艺简单，产品价格低廉。 (1)菌种 绿色木霉 (2)培养基 通过对其固态发酵条件进行单因素优化试验来确定 发酵培养基的最佳碳、氮源种类及添加量为:稻草粉与麸皮的 质量比为9 : 1 ，NH4N03 0.5% (3)发酵培养 最适培养条件为:固液比1 : 3，接种量1mL，pH自 然，培养温度30°C. 培养时间96h。 (4)酶的提取 目前生产厂家只能采用直接干燥粉碎得到固体酶 制剂或用水浸泡后压滤得到液体酶制剂，产品外观粗糙，成品 质量不稳定，杂质含量高。因此，随着液体发酵酶工艺的发展 及菌种性能的提高，采用液体发酵法生产纤维素酶是必然趋势。 （5）工业上生产酶制剂的主要方法为盐析法，盐析剂为硫酸铵。 首先以pH4.8的乙酸缓液与酶按体积1 : 2的比例稀释酶液，在 4°C、硫酸铵饱和度为70%的条件下提取16h，5000r/min离心 20min得到沉淀，即为粗纤维素酶。
2.发酵工艺
（1）培养基
米曲霉的培养基:豆饼粉7. 5%， (NH4)2S04 0.8%，水40%，KH2P04 0.25%，麸皮51. 45%。黑曲霉的培养基(g/L) :新鲜麸皮8.25，米糠 4.5，豆饼粉1. 5， (NH4)2S04 O. 3，K2HP04 O. 06，CaCl2 0.075，水8. 6mL， pH5.5。
思考题
•固体发酵和液体发酵的特点 •蛋白质分离提取技术有哪些
（二）培养基
1、试管斜面培养基:将菌种接种于5g/dL麸 皮汁斜面培养基上，28°C 培养3d后使用或 4°C保存。 2、起始摇瓶培养基:麸皮2g/dL， LAvicel 19/dL， KH2P04 0.2g/dL，蛋白胨0.4g/dL， 酵母粉0.02g/dL，其他各种微量元素，自来 水配制成100mL，自然pH。 3、优化瓶培养基:麸皮335g/dL， LAvicel134g/dL，KH2P04 0.2g/dL，蛋白胨 0.4g/dL，酵母粉0.02g/dL，其他各种微量 元素，自来水配制成100mL，自然pH。
3.发酵过程
（二） α-淀粉酶的提取工艺
1.生产工艺流程 2.提取工艺 3.精制工艺
提取工艺
1）热处理 工业上发酵结束后，在搅拌下 加人无水CaClO. 8% (W /V)，升温至5055°C，保温0.5h，冷至35-38°C ，并调 pH6. 7-6. 8，加(NH4 )2S04或Na2S04盐 析，静置数小时，即可压滤收集酶饼。 2)盐析 热处理后可以直接加中性盐盐析， 也可以将发酵液经压滤除去菌体和培养基 残渣后再盐析。 3)干燥 滤饼一般先经烘房干燥，再用气 流干燥而得成品。
4.酶的质量测定
酶性质的测定:将一定量冷冻干燥 后的酶粉溶于pH 3.0乳酸缓冲溶液 中，制成酶溶液，测定酶的最适温 度和pH，通过Sephadex-G75凝胶过 滤层析及SDS-PAGE蛋白质电泳 分 析，此蛋白酶的分子质量范围为 55-60kDa。
四、纤维素酶
1、纤维素酶种类繁多，来源很广，不同来源的 纤维素酶其结构和功能相差很大，广泛存在于生 物体中，但人和大部分动物体内没有，而反刍动 物体内有纤维素酶。用于生产纤维素酶的菌有木 酶属、曲霉属和青霉属等。产生纤维素酶的菌种 容易退化，导致产酶能力降低。 2、纤维素酶应用广泛，在进行酒精发酵时，纤 维素酶的添加可以增加原料的利用率，并可提升 酒质。由于纤维素酶难以提纯，实际应用时还含 有半纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶等。 3、自然界中的很多真菌都能分泌纤维素酶，由 许多具有高协同作用的酶组成。习惯上将纤维素 酶分成三类:内切葡聚糖酶(Cx)、外切葡聚糖酶 (Cl)和伊葡萄糖昔酶(β G)。
（一）生产菌
1.基础菌种 产纤维素酶的微生物主要是霉菌， 有木霉属、曲霉属和青霉属，此外，反刍动物瘤 胃菌、嗜纤维菌、产黄纤维单胞菌、蒙古细菌、 梭状芽抱杆菌等也能产生纤维素酶。 2.选育菌种 菌种选育是纤维素酶生产的重要基 础性工作，国内外许多专家进行了大量研究。以 绿色木霉木10、绿色木霉5n-91014、康氏木霉 NT-IS、黑曲霉XX-ISA为出发菌株，采用了紫 外线、亚硝基胍等理化因素诱变，获得了高产菌 株NTlS-H、NTlS-HLXT-lSH、XT-lSHl。 其 中木霉NT-ISH固体培养活力经轻工部食品质量 监督检测中心南京站检测表明，滤纸活力为 3670U/g，Cl活力24460U/g， Cx活力 1800U/g，已达到国际先进水平。
（五）酶活力的测定
用滤纸方法测定酶活(FPA) ，取适当稀释的酶液0.5mL，加人到 1.5ml pH4. 8、 0.05mol/L柠檬酸缓冲溶液中，再加入1条1cmX 6cm新华定量滤纸，50℃保温1h，加人 1.5mL DNS试剂终止酶反 应，沸水浴5min，冷却后加水稀释到25mL，用分光光度计在 520nm处测还原糖OD值。纤维素酶活力单位的定义:50℃下，每 小时水解底物生成1µmol 葡萄糖所对应酶活定义为1个酶活国际 单位U[lU/(mL· h)]。 酶学性质研究结果表明:耐碱芽孢杆菌III-3-A的CMC酶反应以 pH9.0、反应温度45℃左右为宜，在pH6-1l和50℃以下酶活性稳 定，且具有耐金属离子和表面活性剂等特性，Ca2+对酶的最适 反应温度和热稳定性有显著影响，添加5mmol/L CaCl2可使最适 酶反应温度和稳定性分别提高至50℃和55℃。该酶其有耐热、 耐金属离子、耐碱及高比活力等特点，在棉织品的水洗整理及 洗涤剂工业中具有良好的应（1）菌种 康氏木霉Trichoderma koningii P12菌株; 绿色木霉、里氏木霉。 （2）培养基 斜面培养基采用麦芽汁琼脂培养基。基本 发酵培养基组成为(g/L) :稻草粉30，麦麸15， (NH4)2S04 8，KH2P04 O. 5， MgSO4 • 7H2O O. 5， 酵母膏1，自来水配制，初始pH5.0，装液量35mL。 （3）发酵培养 发酵培养条件为:取种子培养5-6d，离 心上清液即为粗纤维素酶液。确定最佳发酵条件为: 当装液量为56.5mL、稻草粉浓度为37.4g/L和麦麸浓 度为11. 3g/L时，纤维素酶产量达到 63. 32U/mL。
（一）发酵工艺
1.菌种选择 2.培养基
我国用发酵法生产淀粉酶的常用菌种 为枯草芽孢杆菌，如BF-7658菌株。 枯草芽孢杆菌BF-7658的诱变菌株Ning作 为试验菌株，在10L发酵罐中，采用的培养基组成为: 玉米粉7%，豆饼粉5%，磷酸氢二钠0.5%，硫酸铵 0.4%，氯化钠0.15%。培养条件为:温度(37士1)·C， 罐压0.05MPa，转速360r/min，风量1 : (l-1.2)， 培养时间28h ，获得酶活力为397.2U/mL的α -淀粉 酶。 种子培养和发酵培养
1. 生产菌 2. 发酵工艺
3. 提取工艺
4. 酶的质量测定
1.生产菌
蛋白酶分布广，但由于动植物资源有 限，工业上生产蛋白酶制剂主要利用 细菌和霉。 酸性蛋白酶(最适pH2-5) 产生菌主要是黑曲霉、米曲霉、根霉 等;中性蛋白酶(最适pH7-8)产生菌主 要是枯草芽孢杆菌、米曲霉、栖土曲 霉、灰色链霉菌等;碱性蛋白酶(最适 pH9-11)主要产生菌为枯草芽孢杆菌、 蜡状芽孢杆菌等。
主讲：卢昂
组员：牛志鹏、朱聪、陈超英、 李东根、王振立
酶类生产工艺
一．产酶细胞应具备的条件： 二．酶的产量高 三．容易培养和管理 四．产酶性能稳定 五．利于酶产品的分离纯化 六．安全可靠
第一节
一．淀粉酶 二．脂肪酶 三．蛋白酶 四．纤维素酶
工业用酶
一、淀粉酶
淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类的总 称，广泛应用于饴糖生产、各种发酵 生产的糖化工序、纺织工业的退浆工 序、医药和造纸等方面。根据其作用 方式的不同可分为：α -淀粉酶、β 淀粉酶、异淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。 其中以α -淀粉酶最常用。
（四）酶的提取
通过离子交换和凝胶过滤两步层析法，从耐碱芽孢杆菌III-3 的培养液中分离到分子质量约为89kDa、比活力高达420U/mg的 碱性纤维素酶。具体工艺如下。 1.粗提 将皿-3菌株的48h发酵液以14000r/min的转速冷冻离心 20min，所得上清加入4倍体 、pH8.0的Tris-HCI缓冲液，即得 粗酶液。 2.离子交换层析 使用φ 216cmX 30cm DEAE Sepharose CL 6B层 析柱。缓冲液体系采用pH8.0的 Tris-HCl缓冲液，洗脱液为含 NaCl、pH8.0的Tris-HCl缓冲液。 3.凝胶过滤层析 使用的介质为Hiload 16/60 Superdex200pg预 装柱。缓冲液体系采用pH8.0的Tris­HCl缓冲液。
（2）工艺流程 （3）发酵条件
装料量30g/250mL三角瓶，采用变 温培养， 32℃堆积培养48h，进行翻 料，将温度调 至28℃继续培养至120h。
3.提取工艺
取发酵原料，以缓冲溶液浸提后，离心获得粗酶粉。 浓缩酶制备工艺流程为:发酵液→絮凝→离心→活性炭脱色→纸板过滤→ 超滤浓缩。 （1)絮凝 取刚下罐的发酵液100mL，加人质量分数为0.1%的絮凝剂 NaAl02 ，室温 搅拌10min，然后倒人100mL量筒中观察沉降情况，并 记录清液出现时间为分层时间，每隔 5min测定清液高度，至120min 为止。 (2)离心 将发酵液装人离心管中，在4℃条件下8000r/min离心。 (3)脱色 选择中颗粒活性炭进行发酵液脱色，用量为1%。 (4)纸板过滤 过滤纸板由孔径30-50µm的棉花纤维、石棉和硅藻土组成， 纸板过撞机的压力为0.3MPa。 (5)膜浓缩 由于蛋白酶的分子质量为28kDa，因此选用聚丙烯膜的MMCO(截 留分子质量)为20kPa，操作压力为0.05MPa，温度控制在lO℃左右。