院(系、部) 化学与生物工程学院专业生物技术（师范）年级13级学号姓名组别第二组课程名称植物细胞工程学实验日期2016.3-6
指导老师实验名称植物组织培养综合实验
一、实验目的
1.熟悉MS培养基的组成，掌握贮备液的配制方法
2.学习、掌握植物组织固体培养基的配制和灭菌方法；
3.掌握超净工作台上的接种方法与注意事项，了解接种室的灭菌方法；
4.了解组织培养的基本程序；
5.掌握接种的方法和材料的培养过程；
6.掌握无菌操作技术，包括外植体除菌和接种技术；
7.观察外植体的生长状况、染菌状况，剔除染菌外植体；
8.了解MS培养基和1/2MS培养基的区别
二、实验原理
1.植物细胞的全能性
一切植物都由细胞构成，细胞是构成植物体的基本结构与功能单位。

植物细胞含有全套遗传信息，具有形成完整植物的潜能。

2.植物细胞表现出全能性的条件
1.离体状态；
2.有一定的营养物质，激素和其他外界条件（无菌、温度、pH）；
3.选择性能优良、细胞全能性表达充分的基因型
3.无菌条件
把植物的组织、器官等，使其在人工控制的无菌条件下，使植物在人工培养基上繁殖。

用于进行组织培养的组织、器官和细胞称为外植体。

在组培中外植体都死带菌的，在接种前必须进行表面消毒，这时取得培养成功的最基本和重要的前体。

组织培养的主要过程都是在无菌条件下进行的，所以所有的器材、植物体、接种室都应是无菌的。

4.脱分化与愈伤组织
已有特定结构与功能的植物组织，在一定条件下，其细胞被诱导改变原来的发育途径，逐步逆转其原有的分化形态，转变为具有分生能力的胚细胞的过程称为脱分化。

脱分化所用的化学物质与MS培养基的区别是需要激素诱导。

所以脱分化培养需在MS培养基上添加激素进行愈伤组织诱导。

5.培养基
植物组织培养常用的培养基为MS培养基。

常用的凝固剂是琼脂,它的主要作用是使液体培养基凝固，琼脂本身并不提供任何营养，它只是一种高分予的碳水物从海藻中提取出来，仅溶解于热水，成为溶胶，冷却后(40℃以下)即凝固为固体状凝胶。

琼脂的用量一般在4—10克／升之间。

琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式等有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解而丧失凝固能力，存放时间过久，琼脂变褐，也会逐失去凝固能力。

MS培养基属于富盐平衡培养基，特点是：无机盐浓度较高，元素间的比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲性，因而在培养的过程中可维持较好的稳定性；营养丰富，在一般培养中无须额外加入复杂的有机成分；微量元素种类全，浓度高。

这类培养基是目前使用最广泛的培养基。

6.生长调节物质
包括天然植物激素额人工激素类似物。

植物激素是一类植物自身合成、同时对其生长发育具有重要调节作用的有机化合物。

生长调节物质对于离题培养中的细胞分裂分
化、器官形成和个体再生等均起着重要而明显的调节作用。

一般来说，基本培养基只能保证培养物的生存，维持其最低的生理活动，而只有植物激素的配合使用，才能完成离体培养物中按照需要设计的各个调节环节。

常用的植物组培激素种类主要有生长素类、细胞分裂素类、赤霉素。

1)生长素的生理作用主要是促进细胞分裂和生长，有利于外植体脱分化并启动细
胞分裂，有利于形成愈伤组织。

同时生长素和细胞分裂素的协调作用，对于培
养物的形态建立十分必要。

在离体培养的分化调节中，生长素促进不定根的形
成而抑制不定芽的发生。

在液体培养中，生长素还有利于体细胞胚胎发生。

常
用的生长素有吲哚乙酸（IAA）、奈乙酸（NAA）、二氯苯氧乙酸（2，4-D）和
吲哚丁酸（IBA）等。

在使用2，4-D时，必须严格控制使用浓度和培养时期，
因为高浓度的2，4-D常常抑制器官的发生，在分化培养时不能使用2，4-D
代替其他生长素。

2)细胞分裂素的主要作用是促进细胞的分裂，调节器官分化，延迟组织衰老，增
强蛋白质合成等。

此外，它还能显著改善其他激素。

离体培养中，细胞分裂素
能够促进不定芽的发生，与生长素协调使用能有效调控培养物的生长与分化。

常用的细胞分裂素包括6-卞基嘌呤（6-BA）、激动素（KT）、异戊烯氨基嘌呤
（2ip）、玉米素（ZT）等。

3)赤霉素（GA）是一类广泛存在于植物体内的激素，目前已发现的天然赤霉素
有20多种。

自然界植物体内的赤霉素具有促进细胞伸长生长、诱导花芽形成、
打破种子休眠及诱导单性结实等生理功能。

在离体培养条件下，赤霉素的主要
作用时促进细胞伸长生长，与生长素协同作用对形成层的分化具有一定影响，
同时还能刺激体细胞胚进一步发育成植株。

三、实验材料、试剂和仪器设备
1.植物材料：马齿苋、番茄种子诱导的无菌苗、外植体（盘龙参、波斯菊、金叶女贞、
黄花苜蓿、菊花、香樟、杜鹃、月季）
2.实验药品（试剂）：甲醛、MS培养基母液（见表1）、蔗糖、琼脂、1%升汞、酒精
（75%和90%）、NaOH、HCl、6-BA、NNA、无菌水；
3.仪器设备和实验用具：高压灭菌锅、天平、pH计、超净工作台、电炉、酒精灯、
镊子、解剖刀、剪刀、烧杯、培养瓶、量筒、烧杯、玻璃棒、广口试剂瓶、牛皮纸、
滤纸、培养皿、药勺、支架、打火机等。

四、实验步骤
(一)培养基母液的配制(2016/3/4)
表1
1)每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再
将它们混溶，定容。

2)贮备液III需加热溶解。

混合后调至pH5.5，定容，保存在棕色玻璃瓶内。

3)6-BA：1 mg/mL(溶于少量1N盐酸后以蒸馏水定容）。

NAA：1 mg/mL（先用少量95%乙醇溶解后以蒸馏水定容）。

4)各种母液配制完成后，分别用玻璃瓶贮存，贴上标签，注明母液号、配制倍
数、日期等，放入冰箱冷藏室保存。

一般无机物质的母液在冰箱中可保存半
年以上，有机物质的母液保存时间在半年以内，但若发现有沉淀或霉变,应
立即需重新配制。

2.其他试剂的配置
1) 1 mol/L 的NaOH：1瓶
2) 1 mol/LHCL ：1瓶
3)0.1%的升汞或2%次氯酸钠：每个超净工作台一瓶（用时处理5-30min)
4)70~75%酒精：每个超净工作台一瓶
5)95%酒精：每个超净工作台一瓶
6)75%酒精棉球：每个超净工作台一瓶
(二)培养基的配制与灭菌
1.培养基配制
1)配制培养液（MS培养液）：按每次配制500 mL培养基计，用量筒或者移
液管从各种母液中分别取出贮备液I 25 mL、贮备液II、Ⅲ、Ⅳ各5 mL；
2)溶化琼脂：用粗天平分别称取5g琼脂、15g蔗糖放入500 mL搪瓷缸中，
加入蒸馏水400 mL，用用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体
呈半透明状。

然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸
馏水定容至500 mL，搅拌均匀。

3)调pH：用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶
化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸（5.4～7.0）测培
养基的pH，一直到培养基的pH为5.8为止（培养基的pH必须严格控制
在5.8）。

4)培养基的分装溶化的培养基应该趁热分装。

分装时，先将培养基倒入烧
杯中，然后将烧杯中的培养基倒入组培瓶（50 mL或100 mL）中。

注意
不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。

组培瓶中培养基的量约50 mL 。

每500
mL培养基，可分装10～15瓶。

5)培养基分装完毕后，应及时封盖瓶口。

最后在组培瓶外壁贴上标签。

2.培养基灭菌（高压灭菌）
1)放培养瓶。

将装有培养基的培养瓶直立于金属小筐中，再放入高压蒸气灭
菌锅内。

如果没有金属小筐，可以在两层锥形瓶之间放一块玻璃板隔开。

2)放置其他需要灭菌的物品。

将其他需要灭菌的物品也放入高压蒸气灭菌锅
内，如装有蒸馏水的锥形瓶、带螺口盖的玻璃瓶、烧杯、广口瓶（以上物。