Western Blot一般流程
• 蛋白样品的制 备
• SDS聚丙烯酰胺
凝胶电泳
转膜 封闭 一抗杂交 洗涤 二抗杂交 洗涤 底物显色
蛋白样品的制备
通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 ➢ 水溶液提取法
针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水 溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶 剂。 细胞裂解液： 0.5ml水+0.5ml裂解液+10μl蛋白酶抑制剂+ 10μl 泛酸钠+ 1μl pepstain ➢ 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙 醇、丙酮和丁醇等。 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理：
SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带 有疏水
性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多 数蛋
白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质和 SDS结合后,由于 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足 道,且
（1.凝胶若是没在预冷的转膜buffer中浸泡，就会在转膜过程中出现 凝胶皱缩，导致出现转移条带变形。2.PVDF膜具有疏水性，需用甲 醇浸泡）
转膜顺序： 阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板
转膜条件： 0.35A 250V 1h40min 冰浴中进行转膜 （具体转膜时间要根据目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越 大，需要的转膜时间越长，反之则短。）
转膜的注意事项（二）
• 避免直接用手碰杂交膜，使用镊子。因为手上的蛋白 和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。
• 夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之间没有气 泡存在，否则会导致转膜不完全。
• 保证膜和滤纸的大小和凝胶完全一样，过大和过小都 会影响转膜效率。
• 鸡来源的抗体与PVDF和尼龙膜有较强的结合能力， 从而产生较高的背景，故如果选择鸡来源的抗体最好 使用硝酸纤维素膜（NC膜）。
加样：两边加loading，加样量一样，加样时间要尽量 短，以免样品扩散
电泳：将胶夹好放于电泳槽中，加电泳buffer（内外面 不能联通），将电压调到85V开始电泳，待marker出 现6条带时将电压调到135V，直到溴酚兰前沿跑出胶 后停止电泳。
转膜
膜的选择
硝酸纤 维素膜 （NC）
价格便宜
简单快速封闭非特异性抗体结合
过硫酸铵(APS)（提供引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合
的自由基）
常用凝胶配置比例
ddH2O Arc-Bis
分离胶（12%） 4.95ml 6ml
浓缩胶（4%） 3.05ml 0.67ml
Tri-HCl 3.75ml（PH=8.8） 1.25ml（PH=6.8）
10%-SDS
150ul
50ul
10%-APS
蛋白样品制备的注意事项：
➢细胞数量达5×106个时就可以做WB。
➢将细胞裂解液再离心，收集上清液，加
loading煮样5min
煮沸5-15min，以充分变性蛋白，保证蛋白从空间结构 变为一级结构（多聚体解散为单聚体，氧化状态转化 为还原状态等）。有的也可以在700C加热5-10min， 尤其适用于多次跨膜蛋白的检测（这些蛋白在煮沸状 态下容易聚集，而聚集状态则会影响标本进入凝胶的 效率。）
聚偏二 氟乙烯膜 （PVDF）
需要用甲醇浸泡
价格昂贵
膜的选择
转膜
半干法（用恒流） 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿 润滤纸之间，电转10－30min。 湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置
的缓冲液中，电转45min或过夜。
转膜注意事项（一）
泡膜： 转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移buffer浸泡20min
• 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA 的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的 印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分 析称为Eastern印迹法
Western Blot基本原理
Western Blot：采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测 物 是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二 抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝 酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白 质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体 起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应， 经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目 的基因表达的蛋白成分。
每单位重量的蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同 蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素
凝胶成份
纯净水（ddH2O） 丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 （Arc-Bis） SDS Tris-HCL 四甲基乙二胺(TEMED)（催化硫酸铵形成自由基而加速
丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合）
150ul
50ul
TEMED
15ul
10ul
凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶浓度％ （W/V）
3.5 5.0 8.0 12.0 15.0 20.0 30.0
分离范围（KD)
100-2000 80-500 60-400 40-200 25-150 6-100 6以下
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳注意事项：
做胶：防止漏胶、进气泡以及花胶(水封、插梳子和拔梳子)。
封闭（1h）(封闭时间过短会导致背景过深 )
• 5％脱脂奶粉（如果用生物素标记的二抗，就不能用奶
粉封闭，因为奶粉中含有生物素 ）
• BSA（牛血清蛋白） • Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）
Western blot 详细过程
温州医科大学药学院
定义：
• 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应 的探测反应来检测样品的一种方法。
• Western Blot是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种 实验方法。
• 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上， 并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为 Southern印迹法。