番茄灰霉病内生拮抗菌的筛选及抑菌物质研究张根伟;张丽萍;李书生;程辉彩【摘要】[ Objective ] The aim was to screen endophytic antagonistic bacteria and study it' s inhibitive substance to control tomato gray mold. [Method] Forty-six endophytic antagonistic bacteria strains were isolated from 65 healthy tomato plants which had antimicrobial activity to control tomato gray mold, and one strain which could produce antimicrobial substances was screened out by using PDA well-diffusion method. The inhibition of antimicrobial substances to mycelium and spores of Botrytis cinerea was studied, and the antimicrobial substances was i-dentified through acid precipitation, Sephadex G-50 gel chromatography and agarose gel electrophoresis analysis primarily. [ Result] It was observed under microscope that the antibacterial substances had the mechanism of tearing cell membrane. The antimicrobial substances was identified as 3. 3 kDa of proteins or polypeptide primarily. [ Conclusion] The research result provides reference for the development of new biocon-trol preparation.%[目的]筛选番茄灰霉病内生拮抗菌并研究其抑菌物质.[方法]从65株健康番茄植株中分离到内生拮抗细菌46株,在此基础上通过PDA培养基打孔扩散法进行复筛,获得了1株强烈抑制灰葡萄孢菌的抑菌物质产生菌.研究了该抑菌物质对灰葡萄孢菌菌丝和孢子的抑制作用,并经酸沉淀、Sephadex G-50凝胶层析纯化、琼脂糖凝胶电泳分析对其进行了初步鉴定.[结果]显微镜观察发现该抑菌物质具有列膜抑菌机制,初步鉴定抗菌物质为3.3 kDa左右的多肽类物质.[结论]为开发新的生防制剂奠定了基础.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2012(000)030【总页数】3页(P14789-14791)【关键词】内生菌;短小芽孢杆菌;灰葡萄孢菌;抑菌物质【作者】张根伟;张丽萍;李书生;程辉彩【作者单位】河北省科学院生物研究所,河北石家庄050081;河北省科学院生物研究所,河北石家庄050081;河北省科学院生物研究所,河北石家庄050081;河北省科学院生物研究所,河北石家庄050081【正文语种】中文【中图分类】S182由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的灰霉病是番茄生产上的一种世界性气传真菌病害，可侵染花、果、叶、茎多个部位，低温、高湿环境利于发病，常常造成较大损失［1］。

目前主要使用化学杀菌剂进行防治，由于病原菌易变异产生抗药性，使得化学杀菌剂的使用浓度不断增加，对人体和环境构成威胁。

生物防治由于其高效、低毒、安全等特性成为近年来的研究热点，而植物内生拮抗细菌由于与植物的长期共生关系，成为公认的很有发展潜力的生防菌株筛选来源。

为此，笔者进行了番茄内生菌的分离，筛选出对蔬菜灰霉病菌具有强烈抑制作用的抗菌物质产生菌，并对抗菌物质进行了初步鉴定，以期为开发新的生防制剂奠定基础。

1 材料与方法1.1 病原菌灰葡萄孢菌由河北省科学院生物研究所在番茄上分离得到。

1.2 方法1.2.1 内生细菌的分离纯化。

将采集的健康番茄的根、茎、叶等组织及种子经表面消毒后，无菌水冲洗4次，样品在研钵中研磨，稀释平板法分离内生细菌，30℃培养2～3 d后挑取菌落形态差异明显的菌落保存备用。

1.2.2 拮抗菌的分离与筛选［2］。

对分离的菌株在PDA培养基上与灰葡萄孢菌对峙培养初筛，24℃培养3～5 d，挑取、保存抑菌圈大的菌株。

将初筛菌株在NB培养基液体摇瓶培养，28℃培养3 d，发酵液离心，取上清用0.45 μm过滤器除菌，在病原菌高氏平板上打直径4 mm孔，滴加100 μl发酵滤液，平板扩散法对峙培养，观察抑菌圈，进行复筛，筛选抑菌圈大的抗菌物质产生菌。

1.2.3 抑菌物质对灰葡萄孢菌菌丝和孢子的抑制作用。

挑取抑菌圈周围灰葡萄孢菌的菌丝，显微镜观察菌丝形态;将稀释至不同倍数的无菌滤液与同体积加入5%葡萄糖的番茄灰霉病菌分生孢子(浓度1×108cfu/ml)悬浮液混合，以无菌水加同体积孢子悬浮液为对照，滴入凹玻片，(25±1)℃保湿培养，12、18、24 h后显微镜观察灰葡萄孢菌孢子萌发的变化情况，统计抑制率。

1.2.4 抑菌物质的初步鉴定。

1.2.4.1 Sephadex G-50柱层析分离。

将NB培养基的发酵液过滤除菌，用pH2.5的盐酸沉淀过夜，沉淀用60%乙醇抽提、冷冻干燥后，用蒸馏水溶解经Sephadex G-50凝胶层析纯化，检测波长为280 nm，收集各个吸收峰，进行抑菌活性测定。

1.2.4.2 Tricine-SDS-PAGE检测。

截留具有活性的峰，参考《蛋白质电泳试验技术》［3］进行琼脂糖凝胶蛋白电泳分离，低分子量蛋白肽电泳方法见参考文献［4］，对分离的条带进行抑菌活性测定。

1.2.4.3 蛋白酶K和胃蛋白酶处理。

将蛋白酶K和胃蛋白酶配成5 mg/ml的溶液，分别取0.1 ml于离心管中，分别加入发酵液0.4 ml，使酶的终浓度为1 mg/ml，蛋白酶K调pH至7.0左右，胃蛋白酶pH调至2.0～3.0，同时以0.l ml双蒸水加入0.4 ml发酵液作为对照，37℃温育4 h，测定抑菌活性的变化。

2 结果与分析2.1 菌株的筛选2.1.1 拮抗菌的初筛。

从河北石家庄周边菜地采集番茄植株65个，稀释平板法分离得到内生细菌432株。

以灰葡萄孢菌为指示菌，平板对峙培养筛选出46株具有拮抗作用，其中25株具较强拮抗作用，抑菌圈直径均大于2.5 cm。

2.1.2 抗菌物质产生菌复筛。

采用平板扩散法进行复筛，得到8株对灰葡萄孢菌有较强抑制作用的抑菌物质产生菌，抑菌圈直径均超过了21.3 mm(表1)，其中以D-1菌株抑菌圈直径最大，达到25.5 mm。

7 d后D-1的抑菌圈缩小不明显，说明产生的抗菌物质性质稳定。

2.2 抗菌物质对灰葡萄孢菌菌丝和孢子的抑制作用显微镜下可见菌丝有膨大、断裂、自溶现象(图1);孢子有膨大变形、内容物溢出现象，不能萌发形成菌丝(图2)，说明该抑菌物质具有裂膜抑菌机制。

表1 内生细菌发酵滤液对灰霉菌的抑制作用 mm菌种编号抑菌直径菌种编号抑菌直径D-1 25.5±1.2 C-11 22.5±0.1 B-3 24.3±1.1 D-13 21.9±0.2 C-423.4±1.0 D-18 21.7±0.9 A-7 22.8±1.1 B-20 21.3±1.2由表2可知，抑菌物质D-1原液对孢子萌发抑制率可达98.9%，随着稀释倍数的增大，抑制率有所降低，当稀释倍数为100倍时，抑制率为53.4%。

图1 菌丝形态(×400倍)图2 孢子形态(×400倍)表2 D-1发酵滤液对番茄灰霉病分生孢子萌发的影响 %稀释倍数萌发率抑制率11.1 98.9 10 3.2 96.7 20 16.2 83.4 100 45.5 53.4 CK 97.5 -2.3 抗菌物质的初步鉴定2.3.1 Sephadex G-50柱层析分离结果。

发酵滤液经盐酸沉淀、乙醇抽提，通过Sephadex G-50柱层析，出现2个洗脱峰(图3);活性检测结果表明，峰2具有抑制灰葡萄孢菌活性(图4)。

2.3.2 Tricine-SDS-PAGE测定抗菌物质的分子量。

纯化样品经Tricine-SDS-PAGE电泳分离，用考马斯亮蓝染色脱色后，在凝胶上只出现1条明显谱带(图5)，根据Marker谱带位置，初步确定该条带分子量为3.3 kDa左右。

抑菌活性检测表明，该谱带具有抑菌活性。

图3 抗菌物质的Sephadex G-50柱层析图谱图4 峰2的抑菌效果2.3.3 蛋白酶K、胃蛋白酶处理稳定性。

结果表明，该抑菌物质经蛋白酶K、胃蛋白酶处理后抑菌活性未下降。

图5 Tricine聚丙烯酰胺凝胶电泳结果综上，初步判定该抑菌物质可能为3.3 kDa左右的多肽类物质。

3 讨论植物内生菌是指其生活史阶段生活在活性植物组织中又不引起明显病害的微生物，该类菌对许多作物病害显示出良好的控制效果，具有多种生物学功能，已成为植物病理学、微生物学、植物学等许多学科研究的热点。

目前国内针对番茄内生细菌的研究报道很少，参考国外对其他植物内生细菌的研究，有学者认为植物内生菌由于长期的共生关系，更易分离得到抑制植物病害的拮抗微生物，且一般对植物无害［5］。

该试验从健康番茄植株分离到强烈抑制灰葡萄孢菌的内生拮抗菌D-1，该菌株产生的抑菌物质具有列膜抑菌机制，对孢子的萌发抑制率可达98.9%，稀释100倍仍有53.4%的抑制率;抑菌物质初步鉴定为3.3 kDa左右的多肽类物质。

多肽类抗菌物质大多具有良好的内吸性，有望开发成为新的生防制剂，对其结构、性质的进一步鉴定有待进一步研究。

参考文献［1］杨燕涛.国内保护地蔬菜灰霉病侵染规律及防治技术研究进展［J］.农药，2003，42(l):6-10.［2］张铎，谢莉，张蕾，等.棉花黄萎病拮抗内生菌的筛选鉴定及抗菌物质研究［J］.河北师范大学学报，2008，32(5):673-676.［3］郭尧君.蛋白质电泳实验技术［M］.3版.北京:科学出版社，2005:92-118. ［4］曹佐武.小分子肽的Tricine-SDS-PAGE分离方法［J］.生物学通报，2003，38(3):55-56.［5］FISHER P J，PETRINI O，LAPPIN SCOTT H M.The distribution of some fungal and bacterial endophytes in maize(Zea mays L.)［J］.New Phytol，1992，122(2):299-305.。