第15卷第1期 皮 革 科 学 与 工 程 Vol 115,No 112005年2月L EA T H ER SCIENCE AND EN GIN EERIN G Feb 12005文章编号:1004-7964(2005)01-0026-05收稿日期:20042092183本文是世界著名皮革科学家Brown 博士来华讲学内容的一部分,由四川大学生物质与皮革工程系王英梅、陈武勇翻译整理胶原的结构:天然胶原和改性胶原的网络结构Eleanor M.Brown(美国农业部东部研究中心)摘 要:介绍了美国东部农业研究中心对胶原结构的研究成果,重点介绍了对胶原四级结构的计算机模拟图像,并在胶原结构层次上详细讨论了鞣制机理以及鞣制对胶原构象的影响,最后讨论了胶原的应用。
1胶原1.1 前言自然界可再生的资源有两类,一类是碳水化合物,其中包括纤维素、木质素、淀粉、胶质等;另一类是蛋白质,其中最重要的是胶原,胶原约占动物总蛋白量的30%。
胶原的功能也可以分为两方面:一方面是它的生物学功能,胶原是细胞外间质(ECM )的结构蛋白,也是原纤维的组成成分,比如皮肤、软骨、骨等;另一方面胶原在现代科学技术上也有广泛的应用,比如在分子架构、皮革工业、医学方面和食品方面都有大量的研究和应用。
目前共发现发现的纤维状(由原纤维组成)的胶原有以下几类:Ⅰ型胶原(2α1(Ⅰ)1α2(Ⅰ)),主要存在于皮肤、骨、肌腱;Ⅱ型胶原(3α1(Ⅱ)),主要存在于软骨;Ⅲ型胶原(3α1(Ⅲ)),通常与Ⅰ型胶原共存;V 和XI 型胶原的杂和三体(α1,α2,α3)1.2 胶原的细微结构1.2.1 胶原的细微结构美国东部农业中心多年来致力于胶原细微结构的研究,对其进行了计算机三维图像模拟,在胶原超分子结构方面取得了一系列卓有成效的研究结果。
现在科学界通常认为胶原的细胞外合成过程为以下图示(图1),图中按箭头顺序依次为:多肽链,三股螺旋的胶原分子,前胶原,原纤维。
原胶原的精细结构总体有以下3个要点:(1)每个原胶原分子由三条肽链组成,并且肽链具有重复的氨基酸序列(Gly -Xxx -Yyy )n ,通常图1胶原的细胞外合成过程Fig.1Extracellular steps in t he biosynt hesis of collagen为Gly -Pro -H Pr ;(2)每条链都是左手螺旋,不是α螺旋,每个旋转的部位3个氨基酸残基,螺距0.94nm ,每条肽链大约有1000个氨基酸残基;(3)三条螺旋的肽链盘绕成一个右手超螺旋。
另外人们经研究还发现有以下6种作用共同维持螺旋的稳定性:(1)肽键(2)氢键(3)脯氨酸,阻止了N -C 键的旋转(4)羟脯氨酸,可以与水发生桥连作用(5)甘氨酸,由于甘氨酸是最小的氨基酸,可以使分子间形成近距离的连接(6)侧链相互作用现代显微技术的发展,尤其是原子力显微镜的发明和应用,使得人们可以更直观地观察到胶原的细微结构。
图2、图3即为典型的胶原电镜照片。
图4直观地表示了胶原的超分子结构,由低级到高级(图中从左到右)的结构依次为:(1)微原纤维1968年Smit h 提出胶原微原纤维的左手五股螺旋模型,而其它观点提的模型为4或6股螺旋(2)原纤维MCF 束(3)纤维束1.2.2 I 型胶原I 型胶原是脊椎动物结缔组织中最重要和最常图2皮胶原的电子显微照片Fig.2Elect ron micrographs of skincollagen 图3粉碎胶原的原子力显微照片Fig.3A FM of milledcollagen图4胶原的超分子结构Fig.4Supramolecular structure of collagen见的胶原类型,其精细结构为:(1)由1014个氨基酸残基组成(2)三肽序列为(-Gly -Pro -Y -)和(-Gly -X -Hyp -)(3)端肽为N =16C =26(4)具有周期横纹结构(5)胶原分子为4.4D 的长度,分子间的间隙为0.6D柔性段尺度大约为300nm ×1.5nm1.3胶原精细结构的模型美国东部农业研究中心经过多年的研究工作,给出了胶原精细结构各个层次的模型图,下面挑选一些有代表性的加以介绍。
1.3.1 胶原五股螺旋的模型如图5,不同氨基酸用红、蓝、橙和绿色等不同颜色进行标识图5胶原的五股螺旋模型Fig.5Microfibrilmodel图6胶原模型的各级结构Fig.6Collagen model1.3.2胶原从低级到高级的各级结构模型如图6所示,从左到右依次为:单链———左手螺旋Gly -Pro -Pro 三链———右手螺旋Gly -Pro -Hp r 微原纤维———左手螺旋Gly -Pro -Hpr微原纤维———左手螺旋修正了氨基酸残基图7胶原横纹周期Fig.7D periodicity72第1期 Eleanor M.Brown :胶原的结构:天然胶原和改性胶原的网络结构1.3.3 图7为1个横纹周期的原纤维结构1.3.4 图8为模拟D 周期模型与胶原电镜图片的对比,其中A 为电镜负染照片,B 为电镜正染照片,图8胶原结构Fig.8Collagen structureC 为D 横纹周期的模拟结构对D 横纹周期进行的分析表明:间隙部分和重叠部分在长度上相似;间隙区域为1338个氨基酸残基;重叠部分为1020个残基。
1.3.5 胶原不同层次结构的模型如图9,10,11所示,侧链以不同颜色对功能加以区分。
图9胶原模型Fig.9Collagenmodel图10 三股螺旋的N 端端肽Fig.10N -telopeptide on triple helix1.3.6 典型的胶原交联示意图如下 C 端端肽的空间填充模型,显示氨基酸残基的功能性以及能够产生更多远距离交联的潜在点。
图11N 端端肽的立体模型,显示出氨基酸残基的功能性Fig.11N -telopeptide on triple helix2 鞣制2.1 鞣制过程概要———第1部分(图略)2.2 鞣制过程概要———第2部分(图略)2.3 鞣制机理制革用鞣剂有矿物质鞣剂,如Cr ,Al ,Fe ,Ti ,Zr ,植物鞣剂以及醛、丙烯酸树脂鞣剂。
通常认为鞣制发生在胶原分子内和分子间的交联位置如图所示(图12)。
图12交联示意图Fig.12Intra 2molecular and inter -molecular cross 2links鞣制对胶原的修正作用一般由以下5种物理化学反应实现:—共价键交联—疏水交联82皮革科学与工程 第15卷—氢键—静电相互作用(盐桥)—可变化的水结构,即水的活性那么鞣制作用到底发生在哪个部位呢?根据美国东部农业研究中心多年的研究结果,我们怀疑它是发生在周期结构的间隙上,但此推测有待于进一步证实。
3 对鞣制过程中胶原构象的研究3.1 研究途径我们对于鞣制过程中胶原构象的研究途径有两种,一为评价铬鞣过程的每一步对胶原结构的影响二是用紫外光谱、圆二色谱以及核磁共振方法研究铬鞣过程的不同步骤对可溶胶原的影响。
3.2 研究方法研究方法分为四步:可溶胶原的制备、模拟浸酸、预鞣、固定下面是可溶胶原的分光光度值(文献数据)、天然胶原和热变性胶原的紫外和圆二色谱(图13): E218nm=9.43for1mg/mL in1cm pat hΘ223nm=7500deg cm2dmole-1Θ198nm=-53000deg cm2dmole-1Tm=38.5℃3.3 鞣制方法是胶原(约0.5μL/μL)溶解在乙酸溶液中,调节p H为4,然后用硫酸溶液调节p H至1.8～2.0,以10%Cr K(SO4)2溶液的形式加入8mg Cr,最后缓慢地以Na HCO3溶液调节p H值到4。
得到含Cr和不含Cr胶原的熔融曲线如下:铬鞣对解链温度Tm的影响如下表所示: %helix Tm st d.dev.p H48237.00.4p H27832.00.5p H2wit h Cr6932.6 1.2p H4wit h Cr27>45核磁共振谱显示出模拟鞣制对谷氨酸和天冬氨酸残基的影响3.4 铝鞣铝是无色和非顺磁性的,三价铝的模拟鞣制方法如下:A.B TC在50mmol的乙酸溶液中(300mL)。
B.用1N的硫酸调节p H在1.8～2.0之间。
C.加入10μL的20%Al2(SO4)2溶液。
D.在几个小时内缓慢加入10μL0.5M的Na HCO3溶液,使p H缓慢提高到4。
图13可溶胶原的紫外色谱和圆二色谱Fig.13UV Spectra and CD Spectra of solublecollagen图14四种熔融曲线Fig.14Melt of4tannage stepsE.重复D的操作,但不含铝。
通过以上步骤的操作之后测得铝“鞣”胶原的熔融曲线如图14。
3.5 总结根据以上的研究我们得到以下重要结论:(1)观察到在铬交联之前胶原就有部分变性。
92第1期 Eleanor M.Brown:胶原的结构:天然胶原和改性胶原的网络结构图15核磁共振图谱Fig.15NMRSpectroscopy图16胶原在中性溶液中的透射电子显微镜照片如图Fig.16TEM of collagen in neutral solution (2)铬鞣开始的酸性条件会降低胶原螺旋的热稳定性。
(3)在处理过的胶原的核磁共振谱中,羧酸基团(天冬氨酸和谷氨酸)显著性降低。
4胶原的其它用途除了在制革上作为原料皮的主要成分,胶原还有很多更广泛的应用,如可食用的胶原可用作包装材料(比如作为香肠的肠衣)以及作为肉产品的结构填充等。
另外胶原在医学上的应用也有很多报道,比如作为可植入的生物材料、伤口敷料、人工皮肤、图17铝鞣胶原的熔融曲线Fig.17Melting curve of Al tanningcollagen图18 Al 2(SO 4)3溶液的27Al 核磁共振谱:含胶原和不含胶原Fig.1827Al NMR Spectroscopy of Al 2(SO 4)3图19胶原对铝的松弛时间的影响Fig.1927Al spin lattice relaxation time组织工程的海绵体等。
03皮革科学与工程 第15卷。