福州大学专题报告姓名/学号：王佳婕/10112010517
学院：物理与信息工程学院
专业：通信与信息系统
导师：洪蛤畔副教授
研究方向：生物医学信息的检测与处理
荧光免疫分析定量检测技术
免疫分析(immunoassay , IA)是基于抗原和抗体特征性反应的一种分析技术。

根据标记技术手段的不同，免疫分析主要分为放射免疫分析、酶免疫分析、化学发光免疫分析、荧光免疫分析等[1]。

1941年，Cons等用荧光素和抗体的结合来定位组织中的抗原，提出了荧光免疫分析法（Fluorescence Immunoassay，FIA）的概念[2]。

荧光免疫分析法常用试剂是荧光素，荧光素一直是分析领域中常用的有机荧光分子标记物。

在特定波长的激发光作用下，某些有机荧光分子很容易被激发至饱和状态并发出荧光，而这些荧光分子还能在很短的时间内进行多次的重复激发和测量。

荧光免疫分析法就是根据荧光分子的这种特性进行定量分析的。

一、荧光免疫分析
荧光免疫分析的方法有很多,常见的有以下几种：荧光偏振免疫分析、荧光猝灭免疫分析、荧光增强免疫分析。

荧光免疫分析在国内外被广泛地应用在临床检测中，如内分泌疾病检测（甲状腺、糖尿病及生长素类的检测）、传染病检测（肝炎、艾滋病等）、妇产科疾病检测（HCG、FSH、Testosterone等）、肿瘤标志物检测（AFP、PSA、CA系列）、遗传科疾病检测（产前筛查、新生儿筛查及基因杂交检测等）、血液及细胞学检测（贫血、白血病及细胞试验与分析等）[3]。

免疫组织化学、微阵列、多标记物的免疫分析等新应用也不断地涌现出来[4]。

荧光免疫分析技术的基本原理是将抗原抗体反应的高度特异性
与荧光的可测量性结合起来，以荧光物质作为示踪剂标记抗体（或抗原）制成特异性试剂，可用于检测特定的抗原抗体浓度，以便进一步进行病理学或免疫组织化学的免疫分析[4]。

相对于定性检测和半定量检测，定量检测在临床应用中更具有实际意义。

它可以直接读出待测物质的浓度，为临床诊断提高可靠依据，可应用于疾病的早期诊断。

二、荧光免疫定量检测
1.荧光检测机理
某些物质经紫外光的照射，吸收了一定波长的入射光（紫外光）后，即可发射出较入射光波长稍长的光，这种光称为荧光。

由于物质的分子结构不同，所能吸收紫外光的波长及发射荧光的波长也有所不同，利用这个特性可以对待测物质进行有针对性的检测。

在一定条件
下，待测物质浓度越高，紫外光照射后所发射的荧光越强；反之，浓度越低，所发射的光也越弱；根据荧光强度的强弱，可以对待测物质的浓度进行判定。

任何发射光的物质都存在两个特征的光谱，即激发光谱与荧光光谱。

物质的组成与结构不同，所能吸收入射光的波长和所发射荧光的波长也不同。

待测物质的激发光谱是表征待测物质在不同波长的激发光照射条件下，能产生对应的荧光强度的关系谱图；荧光光谱，是指物质辐射出的不同波长的荧光所对应的荧光强度[5]。

定量检测的关键点之一是根据待测物质的荧光光谱，找到待测物质荧光强度最大点对应的激发光的波长，根据不同浓度的待测物质经特定波长的激发光激励后产生的荧光强度的大小，来确定待测物质浓度的大小。

2. 如何定量表示荧光强度
待测物质浓度的大小对应荧光强度的大小。

如何精确测量荧光强度是实现待测浓度精确判断的关键。

通常借助光电器件和电子芯片。

光强是描述发光强弱的物理量，可以借助现有器件，如光电倍增管[6]等将荧光强度转化为便于分析的电信号（常为电压信号）。

光电倍增管是一种可以接收辐射荧光的光电传感器件。

通常辐射出的荧光强度较为微弱，需要对接收到的信号进行放大、AD转换等一系列的处理之后，才便于进行特征值的分析与提取。

选择分辨率高的AD器件可以实现采样数据的高分辨率分析，减小误差，这样可以提高荧光信号的检测精度和准确度。

荧光免疫分析仪的测量精度取决于其对荧光信号检测电路的抗噪声能力。

采用电流模放大电路和暗电流自动补偿技术可以显著地减小噪声，较大地提高信噪比，提高信号采集精度、灵敏度、稳定性和可靠性，从而提高荧光免疫分析仪的整体性能，提高其检测极限和检测精度[7]。

数据采集系统借助芯片完成，常用于数据采集与控制的有单晶芯片微型计算机、超级精简指令集机器ARM、数字信号处理器DSP等。

已有文献中，使用DSP的强大数据处理能力，来实现数据的采集与转换较为多见。

三、一种荧光免疫检测仪
国内外荧光免疫定量检测的专利和文献有很多，检测对象多样，但是荧光的检测一般以激光激发荧光检测较为常见。

检测的手段可以对采集到的荧光图像来分析[8]，也可以是对荧光强度的评估。

下面是一种典型的双通道（绿光激光器和红光激光器两个激光通道可供选择）激光激发荧光检测生物芯片荧光强度的仪器，该仪器可
以实现现了双光路生物芯片激光共聚焦扫描定量检测系统[9]。

激光共聚焦扫描仪工作原理框图
在该设计系统中，生物芯片是一类能对生物分子进行快速并行处理和分析的指甲盖大小的薄型固体器件[10]。

如常见的试条，也算是一种生物芯片。

整个仪器分成以下几个部分[9][11][12]。

光学系统部分
该部分的主要功能是引导激发光路汇聚激光到待检测生物芯片上，诱导芯片上的荧光分子产生荧光，并通过荧光汇聚光路汇聚到光电倍增管PMT上，生成可供A/D 进行采样的电压信号。

分辨率、灵敏度、信噪比是光学系统要考虑的性能指标。

运动系统部分
通过对运动平台的精确控制可以使生物芯片上位于扫描范围内的任意一点运动到光学系统的焦点上，进而实现二维平面扫描。

控制运动系统的运动速度、精度、平稳度，才能降低运动系统对整个系统的影响。

数据采集及信号处理部分
实现信号的适当放大是数据采集的基础，在放大部分也需要考虑抗噪和稳定性。

对PMT 输出的信号进行滤波，去除环境和系统噪声，并对信号进行放大，使之适合AD采样的幅值要求，提高系统的动态范围。

由于系统中各部分因素的影响，在进行荧光值和浓度值之间的关系拟合时，需要找到合适的数学曲线模型，采用多参数对数拟合是一种常用的思想[3]。

通信及应用程序控制部分
通信部分可以实现系统的指令和数据的传输，应用程序实现计算机和扫描仪之间的控制操作，并对仪器进行控制。

主要包含指令传递、数据传输等。

激光器发出的激光经过光路选择器选通后，照射到生物芯片上，芯片上的荧光物质受激发产生荧光。

荧光经反射、透射、滤光被光电倍增管接收，并进行光电转换，得到的电信号经过放大滤波，再由
A/D将模拟信号转化为数字信号。

实现对数字信号的处理之后，可以找到特征值与浓度间的对应关系曲线，从而建立一种可以较为精准地估测待测物质的方法。

整个系统调试完成以后，对检测的控制是通过简单的按钮操作实现的，这极大地提高了检测的效率，体现了智能医疗仪器在临床检测中的应用。

现代荧光免疫分析技术主要朝着两个方向发展[13]。

一是新型荧光物质的探索，寻求纳米级颗粒的稀土元素晶体作为抗原抗体反应的结合物，其在特定激发光激发的条件下，比一般荧光物质（如镧系离子）具有更小的背景干扰、更高的系统稳定性和可靠性。

另一方面，结合现代芯片技术和光电检测技术，可以弥补试剂本身带来的各种噪声和干扰，提高测试仪器的整体性能。

精确和定量是免疫检测仪器追求的目标。

随着荧光免疫分析技术的不断发展，荧光免疫检测将在生物医药临床定量检测中发挥不可替代的作用。

参考文献
[1]李振甲. 国内外标记免疫分析技术研究现状[J]. 中华医学检验杂志, 1999, 22(5).
[2]张振亚,梅兴国. 现代荧光免疫分析技术应用及其新发展[J]. 生物技术通讯.
2006,17(4).
[3]管华,石茂健,崔亚男. 免疫分析技术进展[J].亚太传统医药,2007,3(10).
[4]田振. 时间分辨荧光分析技术及测试仪的研究[D]. 华南师范大学硕士论文, 2003.
[5]陈康. 荧光免疫分析仪基本组成、原理及进展[J]. 中国医疗设备,2009.
[6]胡春华,王忠林. 荧光检测中光电倍增管的增益电压控制[J]. 中国科技信息, 2007.
[7]王慧锋，秦添. 微弱荧光信号检测电路抗噪声能力对时间分辨荧光免疫分析仪测量精度的影响,中国组织工程研究与临床康复. 2009,13(4).
[8]余勇,胡松. USB2.0技术在生物芯片扫描仪荧光图像采集中的应用[J].自动化技术与应用，2005,24(11).
[9]罗磊. 生物芯片激光共聚焦扫描仪硬件电路设计[D]. 华中科技大学硕士论文,2005.
[10]马立人，蒋中华. 生物芯片[M]. 北京：化学工业出版社，2002.
[11] 陆祖宏,王立强. 生物芯片分析仪专利,CN1385690.
[12] Lipshuze RJ, Fodor SPA et al. High density synthetic oligonucleotide arrays.
Nature Genetics ,1999,21(1):Suppl 20-24
[13]YONGMINKIM, SANGWOOKOH,etc. Development of an Ultrarapid One-step Fluorescence Immunochromatographic Assay System for the Quantification of Microcystins.
Environ.Sci.Technol.2003,37,1899-1904。