荧光显微镜
荧光显微镜的装置
一、光源
现在用高压汞灯作光源
二、滤色系统 （激发滤板和压制滤板） 德国产品（Schott）BG12 、中国产品QB24 、有 的滤板也可以透光分界滤长命名，如K530 、滤板 完全以数字命名，如美国Corning厂的NO：5-58 三、反光镜 反光镜的反光层一般是镀铝的 四、聚光镜 （明视野聚光器 、暗视野聚光器和相 差荧光聚光器）
测定：药物、维生素和激素等
三、荧光酶免疫测定
碱性磷酸酶标记抗体或抗原，固相载体包被抗原或 抗 体 ， 酶 分 解 4-MUP ， 脱 磷 酸 根 基 团 形 成 4-MU ， 360nm激发光照射，发出450nm荧光。
酶和荧光底物
标记酶 碱性磷酸酶 β-半乳糖苷酶
底物 4-MUP 4-MUG
均相荧光免疫测定： 荧光偏振免疫测定
荧光免疫技术的优缺点
优点：特异性强、敏感性高、速度快
缺点：存在非特异性染色，结果判定 的客观性不足，技术程序也较复杂
荧光产物 4-MU 4-MU
激发光(nm) 荧光(nm) 相应信号 360 360 450 450 10 10
辣根过氧化物酶
HPA
二聚体
317
414
0.03
方法类型
双抗体夹心法 双抗原夹心法 固相抗原竞争法
测定：抗病毒抗体、细菌和毒素抗原、 激素、肿瘤标志物等
非均相荧光免疫测定： 时间分辨荧光免疫测定 荧光酶免疫测定
荧光显微镜技术的应用 荧光免疫测定的应用
荧光免疫技术基本原理
采用荧光素标记抗体与组织或细胞抗原 反应，经过洗涤分离后，荧光显微镜下观察 呈特异性荧光的抗原抗体复合物及其存在部 位，借此对组织细胞抗原进行定性和定位检 测或对自身抗体进行定性和滴度测定，又称 荧光抗体技术。
荧光显微镜原理
利用一定波长的激发光对样品进行激 发，产生一定波长的荧光，对样品结构或 其组分进行定性、定位、定量观察检测。
（一）载玻片 载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间 （二）盖玻片 盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁 （三）标本 组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在 标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。 （四）封裱剂 封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度 在pH8.5～9.5时较亮，不易很快褪去 （五）镜油 一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油， 最好使用特制的无荧光镜油
1、时间分辨
自发荧光寿命短:1ns～10ns 镧系元素寿命长:10μs～1000μs 短寿命荧光完全衰变后再测定镧系元素特异荧光
2、stokes位移(斯托克斯 )
激发光谱和发射光谱的波长差 镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光谱和 发射光谱不重叠
3、发射光谱和激发光谱
发射光谱带较窄：613nm±10nm，干扰少 激发光谱带较宽：300nm～350nm，灵敏度高
·
数据记录及处理
荧光显微镜和普通显微镜的区别
1.照明方式通常为落射式，即光源通过物镜 投射于样品上；
2.光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普 通显微镜； 3.有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除 可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线， 用以保护人目。
荧光显微镜技术的应用
1、病原体检测
快速检测病原体，也可检测患者血清中特 异性抗体水平
5、特殊应用：流式细胞分析
将游离细胞作荧光抗体特异染色后，在特 殊设计的仪器中通过喷嘴逐个流出，经单色激 光照射发出的荧光信号由荧光检测计检测，并 自动处理各种数据。
荧光免疫测定的应用
一、时间分辨荧光免疫测定
利用具有双功能基团结构的螯合剂， 将镧系元素（铕(Eu3+)、钐(Sm3+)、铽 (Tb3+)、钕(Nd3+)、镝(Dy3+)）标记到抗 体（或抗原）上，经免疫反应形成复合物， 由于镧系元素能发出荧光，故分离除去未 结合的成分后，利用时间分辨荧光仪即可 测定荧光强度，从而推测待测物含量。
五、物镜
各种物镜均可应用，但最好用消色差的物镜 六、目镜 在荧光显微镜中多用低倍目镜，如5×和6.3× 七、落射光装置
透射荧光显微镜光路
落射荧光显微镜光路
荧光显微镜的操作
1、安装紫外防护罩。 2、打开高压汞灯的电源控制箱开关。 3、插入挡光板，中断光路。 4、预热5—10分钟。 5、将载有样品的载玻片放到载物台上。 6、选择接物镜(按照先低倍，后高倍顺序)。 7、旋转分光镜组件转盘，选择所需要的分光镜组件 8、使用阻断滤片(目前多数阻断滤片内置于荧光显微镜) 9、通过粗、细螺旋调整焦距。 10、打开与显微镜连接的计算机，点击数码成像系统 软件，采集数码图像。
国产高压汞灯GCQ-200型性能良好，可以代 替HBO-200等型的进口灯泡，平均寿命在 200h以上，价格也比较低。
注意事项
•必须安装紫外防护罩
•打开汞灯后不可立即关闭
•汞灯熄灭后待完全冷却才能重新启动
•工作环境温度不宜太高，必须有良好的散热条件 •汞灯的使用寿命达到300小时，需更换新灯泡
荧光显微镜标本制作要求
2、自身抗体检测
抗核抗体 (均质型)
抗核抗体 (斑点型)
抗核抗体 (核膜型)
用于检测学种种抗核抗体、抗平滑肌抗体、 抗线粒体抗体等自身抗体
3、免疫病理检测
肿瘤 （人肝癌细胞）
检测组织中免疫球蛋白、补体、抗原抗体复合 物以及肿瘤组织中肿瘤相关抗原的坚定
4、细胞表面抗原和受体检测
荧光免疫技术可用于淋巴细胞表面CD抗原、 抗原受体、补体受体、Fc受体等的检测以及淋 巴细胞及其亚群的鉴定和计数。
4、荧光标记物的相对比活性
比活性：单位时间每个标记分子被探测的信号量
荧光激发光源1000次/S激发，比活性提高
5、信号增强
标记方法
双抗体夹心法 固相抗体竞争法 固相抗原竞争法
测定：蛋白质、激素、药物、肿瘤 标记物、 病原体抗原/抗体等
二、荧光偏振免疫测定 利用荧光素经单一波长的偏振光照 射后吸收光能，释放出相应的偏振荧光， 荧光偏振程度与荧光分子大小成正比的 关系而建立的免疫分析技术。