自由Cu点击化学
在19世纪后期,Michael 第一个发现了叠氮化合物和炔烃的环加成反应生成三唑化合物,在20世纪中期,Hulsgen花了大量的时间分析环加成反应的机理,产生了物理有机化学科目分支,可以把这个反应转变成正交反应。
与斯陶丁格连接反应一样的是,环加成反应最大的不足之处,用传统未活化的炔烃反应,反应的动力学很弱,需要很高的温度和压力, Hulsgen反应确实需要高温高压,但是这远远超过了生物系统所承受的极限。
在21世纪初期,Sharpless and Meldal注意到了Huisgen环加成反应可以作为一种得到一对选择性高功能分子,他们独立发表了通过Cu作为催化剂可以大大提高末端炔烃的反应速率。
今天,这个反应被作为Cu点击化学一个典型反应,已经被使用在很多的领域,包括生物化学,它也是正交反应,主要不好的是Cu 具有生物毒性。
已经有几个实验室致力于减少Cu的毒性,或者经过配基优化增加催化剂的相关性,最近已经成功实现了叠氮化合物与末端炔烃的反应在活生物体中反应。
我们一直追求避免使用金属催化剂,希望通过采矿业的经典机械理论发现一种对生物友好的叠氮化合物与炔烃的反应。
在1961年Wittig and Krebs报道了环辛炔是一种最不稳定的炔烃,和苯基叠氮化合物反应像爆炸一样。
我们可以推断出在环辛炔与环加成反应中有18cal/mol的热量释放。
通过一个假定的Cu自由点击化学,我们可以合成一些可以作为生物探针功能的环辛炔,在图8A中的OCT化合物可以与生物素连接进行生物标记的研究。
线性炔烃本质上不会与叠氮化合物反应在生理温度的条件下。
但是,OCT-biotion 能很容易与标记了多糖的叠氮化合物反应在细胞的溶解产物中。
在图8B C中,化合物没有表现出明显的毒性,与Cu作为催化剂完全相反,然而,在模型反应中的二阶速率常数0.0024/ms,OCT没有比斯陶丁格反应更快,并且化合物水溶性也有限。
我们着手通过分子改造加快反应速率和提高物理性能为了应用于活体成像。
“aryl-lessoctyne” 13 (ALO)有很好的水溶性,但是反应动力学性能与OCT差不多。
通过在丙炔位置加入吸电子的F原子得到一氟化环辛炔MOFO(14)反应速
率得到大大的提高。
MOFO证明比OCT和ALO的反应都要快,因此,标记的叠氮化合物在细胞溶解物和细胞表面都很快。
在丙炔位置加入两个F得到二氟化环辛炔DIFO(15),能增加Cu自由点击化学反应速率几个数量级。
Boons和他的同事后来报道了通过连接两个芳基环到环辛炔中心,也能得到相同的速率提高。
我们也能添加一个酰胺键到DIBO速率也能提高一个数量级,得到BARAC (17)k=0.96/ms。
在BARAC的环外加个氨基化合物得到18DIBAC,并且它和叠氮化合物的速率常数0.31/ms,另外,DIBO的其他形式也报道过如(19、20),也有Keto-DIBO经过光谱的改变在与叠氮化合物生成三唑化合物。
这些不同的环辛炔反映了在模糊的化学反应的形成过程分子改造的机理从20世纪中期进入高效的生物正交反应时代。
环辛炔和叠氮化合物反应的二阶速率常数确实反映了环辛炔探测生物体内叠氮化合物的能力。
正如图10A中,DIFO试剂化学标记细胞表面叠氮化合物比磷化氢试剂敏感的多,而且,DIFO,DIBO,和BARAC的细胞表面的标记效率跟相关反应一致(图10B),所有的三种环辛炔都连接了F在活细胞中也叠氮化合物多糖成像(图11),BARAC反应速率的提高能够低浓度探针成像而不需要通过冲洗步骤来去除多余的探针。
化学正交反应的第一个运用活体中成像可以通过使用DIFO与叠氮化合物的反应得到,我们利用DIFO-Alexa Fluor 连接物(DIFO-488,DIFO-555,)去探测在线虫和斑马鱼中细胞表面的糖基化的时空上的改变。
用Ac4GalNAz作为新城代谢的标记,线虫发展三个阶段的糖蛋白成像。
在咽部、生殖器、肛门等部位可以观察到明显的标记(图12A),用相同的方式,GALNAZ标记的糖蛋白在斑马鱼的胚胎中成像在60到73h受精后。
动态标记也能检测到在鱼蓟、额中,受精后的多糖变化通过脉冲追踪实验观察到(图12B)多糖的表达在斑马鱼胚胎早期能被探测到通过在显微镜下直接注射GalNAZ和UDP-GalNAz 进入单个细胞胚胎的蛋黄中。
用这个技术,叠氮化合物多糖能够在受精后7h成像。
(图12C)
老鼠是一个很好的模型研究人类疾病,特别是癌症。
因此我们一直使用
DIFO探针在活体中成像。
然而,DIFO和叠氮化合物快速的反应动力学没有能够在小鼠体内实现。
的确,与磷酸氢进行比较,DIFO试剂与叠氮化合物多糖反应效果不是很明显在小鼠淋巴细胞中。
(图13A)。
为什么反应慢的斯陶丁格反应会有优于反应快的Cu自由点击化学反应?我们发现DIFO,是一个疏水性的碳氢化合物,能与鼠体中血清血蛋白强烈的结合,可能导致了隔离了叠氮化合物
为了充分利用好环辛炔反应,我们要提高环辛炔水溶性和药代动力学性能。
亲水性的DIMAC(22,图9)被设计达到这个目的。
DIMAC比DIFO的反应慢。
然而,DIMAC有更好的水溶性,减少非特异性蛋白质结合在鼠体中。
DIMAC 的提高的水溶性并没有弥补弱反应动力学(图13B),环辛炔依然还需要进一步的优化为了得到药代动力学和反应速率的平衡。
BARAC的类似物就只一点来说还是有前景的。
因为它们也反应并且也结合MSA在折合水准与DIFO比较,BARAC轭合物作为活体成像试剂是重要的一步。
另外为了得到生物学家的注意,Cu自由点击化学在现代的物理有机化学引
起了很大的兴趣,特别是理论家,几个组织已经一直在物理基础上解释环辛炔在环加成反应中比直线型炔烃速率快,还有F的影响,芳基环的融合还有其他在反应动力学方面的改造。
用密度功能理论(DFT)Houk和他的同事总结了环辛炔中的弯曲的角度能够增加环加成反应速率,因为最小程度变形需要达到过度状态。
Goddard和他的同学也研究Cu自由点击化学通过DFT计算并且提出带有芳基环的环辛炔可以达到一个平衡在增加键度与最小程度减少位阻。
理想的情况是芳基环融合在环辛炔的5,6位置(23图14),但是23先前显示不稳定。
然而,最近Van Delft和他的同事实现了环辛炔分子末端修饰达到反应位置。
他们呈现了BCN与DIBAC/ADIBO有相似的反应速度,因为来自融合环丙基组合键的效应和减少位阻在炔烃周围。
我们一直在DIBO和DIFO中进行修饰组合合成了25DIFBO.然而化合物和叠氮化合物反应迅速,它不是很稳定并且在浓溶液中齐聚反应,尽管如此,DIFBO 告诉我们提高速率分子修饰的相关贡献。
为了方便比较,我们准备26(MOBO)测定它的二阶速率常数是0.0095/ms,因此,DIFBO是MOBO的反应的20倍,然而MOBO仅仅是OCT的8倍,这些结果表明F的电子效应是主要的原因导致速率提高,应该能有助于环辛炔的优化关于反应速率和稳定性平衡。
理论和机械论工作都有助于对环辛炔分子修饰设计有更深的理解,然而,Cu自由点击化学不仅是对物理有机化学有帮助的正交反应,例如,一个最近的正交反应摘要,四嗪达到了一个最佳的反应速率22000/ms,有理论的指导,四嗪和反式环辛炔的反应是目前了解的最快的正交反应。
这些例子强调了实验与理论在生物化学领域的机遇。
结论
化学正交反应已经逐步形成了一个相当不寻常的领域,能够把传统的化学机械论,方法论反应。
细胞生物,和生物医学结合在一起,对于这样与理论化学和医学成像不同的现象也不是很惊讶。
在我们的工作上面总结了。
我们迫使要了解反应中短暂的中间产物,为了发展新的合成路径,获得不要的关于蛋白质和细胞的产物,在细胞的内在化过程追踪探针,分解胚胎对反应产物分布进行定位,观察实验室动物的健康状况在做化学正交反应的时候。
对于这样的工作合作是很重要的,因为没有一个单独的实验室能够掌握如此宽广的试验方法。
现在,在它的第二个二十年,化学正交反应提供一些经验。
首先,根据上面的例子还有很多其他的例子都证明了化学反应确实能根据需要进行设计,在生物体内也是很有趣的。
在努力中要取得成功需要敏锐的理解对有前景的反应原型,并且也需要勤奋在机械的优化过程。
第二,生物学家急切要来自化学方面的工具,但是它们必须可以利用而且使用起来简单。
辛运的是,几个商业供应商现在提供叠氮化合物或者标记了糖,氨基酸,脂肪和其他生物分子基质的炔烃,也有补充的探针用于探测,这样的装备能够使用化学正交反应,在化学循环技术很普遍。
这些商业装备的的成功无疑于化学正交反应本质上是低技术有关。
毕竟,那个试剂应该互相发现和反应无论周围环境多复杂。
最后一个经验关于反应的发现作为化学正交反应的基础,目前正交反应转变根据少数的原型反应是很久以前生物化学界面发现。
Staudinger、Huisgen 、
Wittig他们都不能预见他们的发现有一天能产生一种在活体生物分子成像的方法。
同样地,当代的基础化学性研究能有未预见性影响在生物里。
这样的研究还是应该鼓励,尽管特别的运用还没有出现。
毕竟,今天发现的一些反应步骤产生的原型反应能够为了明天生物正交反应的发展。