发酵法生产色氨酸的研究刘辉 047111230摘要：色氨酸是人和动物生命活动中8种必需氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着非常重要的作用。
随着市场需求的不断增加，提高色氨酸生产能力成为全球热点。
本文综述了色氨酸应用及生产技术包括发酵生产色氨酸的菌种选育、发酵培养基原料和发酵工艺等方面的研究进展。
关键词：发酵法色氨酸1、发酵法生产色氨酸过程中的菌种选育生产菌种选育是发酵工业中最为关键的工作,受到普遍的重视。
过去发酵法生产色氨酸采用的是在培养基中添加吲哚或邻氨基苯甲酸的方法,此法因必须采用高价的吲哚或邻氨基苯甲酸做前体物质,使色氨酸的生产存在着成本高的缺点。
而且由于这些前体物质对微生物的生长有毒害作用,故不能大量使用[1]。
目前,利用糖质原料直接发酵生产色氨酸的国内外报道不多[2-3],主要是因为色氨酸在微生物体内代途径较长且存在着多种严格的调节机制,致-色氨酸的生产菌种产酸较低,达不到工业化生产的要求。
色氨酸的生产菌种有谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutanicum)、黄色短杆菌(Bre-vibacteriumflavum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus sub-tilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、产朊假丝酵母(Candida utilis)等,其中绝大多数为细菌[1]。
2、发酵法生产色氨酸过程中的发酵条件的选择色氨酸发酵过程中菌种的质粒稳定性对发酵水平高低有严重影响，维持发酵高产酸就要保证发酵过程菌种质粒稳定。
在培养过程可以通过调节适当罐压、培养温度、溶氧控制水平、底料中酵母抽提物添加量等方面进行控制，保证发酵过程中不发生质粒丢失现象。
色氨酸发酵液中乙酸浓度高时对色氨酸生产菌的生长和产酸均有抑制作用，发酵过程中可以通过调节溶氧控制水平、初始葡萄糖浓度、发酵葡萄糖浓度及控制菌体比生长速率等方面进行控制，减少发酵液中乙酸的生成。
色氨酸发酵过程中产大量的热，为了维持发酵温度的稳定，必须采取适当的降温措施，在发酵罐外部加上冷却盘管，采用冰水降温,控制发酵温度33℃左右。
色氨酸发酵过程中由于无机盐的消耗及产酸引起PH 变化，所以发酵过程中适当流加氨水或液氨调节PH，控制最佳PH 值在 6.9 左右。
色氨酸发酵为耗氧发酵，并且产酸过程中用氧量比较大，溶氧的多少直接影响着代谢的方向，进而影响产酸和转化率，溶氧低于20%容易发生菌体自溶、乙酸产量增加，所以在主发酵过程中必须控制溶氧大于20%，这要求我们采用先进的通风搅拌装置，设计合理的发酵罐径高比，增加通气量提高溶解氧。
色氨酸发酵过程中，采用高糖流加技术，使发酵糖浓度始终处于低浓度，从而有效减少残糖对发酵产生的抑制作用，避免发酵后期产生乙酸上升的现象，保证高产酸及转化率。
此外，色氨酸发酵生产可采用先进的培养基连消技术，高精度空气膜滤技术，使发酵污染程度控制最低水平，确保发酵产酸水平；对发酵车间的环境定期进行消毒，提高环境清洁度，对排污要控制，对排污口要用漂白粉处理，对空气过滤系统要定期清理，减少染菌机率。
［4］3、发酵法生产色氨酸过程代谢控制芳香族氨基酸的生物合成存在着特定的代谢调节机制,因此不可能从自然界中找到大量积累色氨酸的菌株，但是可以黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌等为出发菌株,设法得到从遗传角度解除了芳香族氨基酸生物合成正常代谢调节机制的突变菌株,用微生物直接发酵法生产色氨酸"这些方法包括:解除菌体自身反馈调节、切断支路代谢、增加前体物的合成等。
[5]4、发酵法生产色氨酸产物提取工艺色氨酸的工业生产常常会受到生产成本的制约,而在生产成本的结构中,分离纯化等下游工程的成本占有相当大的比例。
据报道,从发酵液中分离纯化L-色氨酸的方法有离子交换法[6]、结晶法[7]等,其中离子交换法具有工艺简便、投资少、节能、污染少的优点,很适合于工业推广。
徐琪寿[8]等采用D061阳离子交换树脂从发酵液中分离纯化L-色氨酸,提取率为45%~50%。
梅丛笑等[9]采用003*7阳离子交换树脂从发酵液中分离纯化L-色氨酸,提取率为68%。
用001*7阳离子交换树脂吸附L-色氨酸,浓缩结晶得到成品的总提取率为73.10%[10] 5、不同菌种生产能力的比较先后有Osamu Kurahashi等[11-12]、Katsumata Ryoichid等[18]根据代谢控制发酵原理对L-色氨酸发酵进行了研究。
王健等以谷氨酸棒杆菌Tx5-32为出发菌株,经硫酸二乙酯(DES)多次诱变处理,定向培育出1株L-色氨酸生产菌TQ2223。
在优化条件下,该菌株发酵64 h产L-色氨酸7128 g/L[13]。
Ikeda以谷氨酸棒杆菌为出发菌株,经诱变得到的KY9456(Phe-+Tyr-)使色氨酸积累达到0115 g/L[14]。
近年来基因工程技术的发展为色氨酸的菌种选育提供了一个有效途径,也是今后育种的主要方向[15-16]。
目前,基因工程技术主要是通过基因扩增,增大生物合成途径中的限速酶(DS酶基因、trpE、trpD、trpC、trpB、trpA)的表达量,进而提高色氨酸产量。
其次是通过对某些酶的基因进行体外诱变造成该基因所编码的酶不可逆失活,再将突变基因导入色氨酸生产菌中,解除Trp的反馈调节或切断分支代谢从而有利于色氨酸的积累[15-16]。
如将与Trp合成有关的基因克隆到质粒pDTS9901上,然后导入Trp生产菌BPS-13中,产色氨酸3512 g/L(亲株产2011 g/L)[17]。
Aiba等构建了包含trp操纵子基因(其中trpE和trpD 基因失活)表达载体并克隆到E1coli,使色氨酸产量达到了612 g/L[18]。
针对葡萄糖代谢流途径的基因包括pgi、serA、PRPP合成酶基因等[15]。
Yajima Yoshihiro等人从色氨酸生产菌(枯草杆菌)中分离出含PRPP合成酶的基因片段,将其克隆到质粒pSEY146112上，导入具有5-FTr 的枯草杆菌中,转化后PRPP合成酶的活力比原始菌提高319倍。
该工程菌在含邻氨基苯甲酸01000 8 g/L时发酵,产色氨酸量比原始菌株提高1~1125倍[19]。
Ikeda等人将来源不同的色氨酸代谢途径中关键酶包括DS酶基因、色氨酸合成基因簇、ANS酶和PRT酶基因同时进行谷氨酸棒杆菌KY10894菌株过表达,色氨酸产量提高了54%,达到43 g/L[20]。
接下来将上述酶基因和酮糖转移酶基因转入色氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌KY9218中进行过表达,色氨酸产量达58 g/L,是目前报道的最高水平[21]。
6、色氨酸的市场需求量目前世界上Ｌ一色氨酸年产量约10000多吨。
据预测，Ｌ一色氨酸未来的需求市场为120万吨。
国内Ｌ一色氨酸的生产技术与国外相比还有较大的差距，目前只有少量生产，大规模的工业化生产还未见报道。
[1] 范丙基.氨基酸工业大全[M]1北京:轻工业出版社,1991:84-911[2] 张素珍.产L-色氨酸菌株的诱变选育[J].微生物学报,1984, 24(3): 235-2421[3] 刘晓婷,黄耀辉.黄色短杆菌L-色氨酸产生菌的选育[J]1工业微生物,1989, 19(6): 6-111[4] 冯雨发酵法L- 色氨酸生产研究科技向导,2011, 27(6): 6-111[5] 王建直接发酵法生产L一色氨酸的研究天津科技大学博士学位论文[6] Shokei N, Naohiro M, Kiyoo M1Separation method ofaminoacids: EP,428984 [P]11991.[7] Yoshinari S,Ryuta T,Masarn S.Crystallising aminoacid to givehighly pure crystals at low cost,using surfactant and/or alcohol:US,9009372 [P]119901[8] 徐琪寿.发酵液中L-色氨酸的提取[J].氨基酸和生物资源,1978, 2(3): 11-141[9] 梅丛笑,王福荣1L-色氨酸提取工艺的研究[D].天津:天津轻工业学院,20001[10] 郭长江,杨继军,韦京豫.发酵液中L-色氨酸分离纯化工艺研究[J].氨基酸和生物资源,2007, 29(3): 42-461[11] OsamuKurahashi, KenzoYokozeki1Production ofL-tryptophan by5-fluorotryptophan and indolmycin resistant mutants ofBacillussubstilisK1[J]1J Agric Biol Chem, 1987, 51(1): 231-2351 [12] Osamu Kurahashi , Mayumi Noda-Watanabe1Production of L-tryptophan by azaserine-, 6-Diazo-5-oxo-L-norleucine-and cinna-mate-resistant mutants ofBacillus substilisK1[J]1J Agric BiolChem,1987, 51(7): 1791-17971[13] 张克旭,陈宁,张蓓,等1代谢控制发酵[M]1北京:中国轻工业出版社,19981[14] 王健,陈宁,张克旭.L-色氨酸生产菌的选育及其发酵条件的研究[J].氨基酸和生物资源,2003, 25(3): 41-431[15] Masato Ikeda1Towards bacterial strains overproducing L-trypto-phan and other aromatics by metabolic engineering[J]1Appl M-icrobiol Biotechnol12006, 69: 615-6261[16] 陈涛,陈宁.L-色氨酸的生产及其代谢控制育种[J]1生物技术通讯,2000, 11(2): 141-1451[17] IkedaM, Nakanishi K, KinoK1Fermentative production oftrypto-phan by a stable recombinant strain ofCorynebacterium glutam-icumwith a modified serine-biosynthetic pathway [J]1BiosciBiotechnol Biochem,1994, 58: 674-6781[18] Aiba S, Tsunekawa H, Imanaka T1New approach to tryptophanproduction byEscherichia coli: genetic manipulation of compositeplasmids in vitro[J]1Appl Environ Microbiol11982, 43: 289-2971[19] Katsumata R, Kino K1Process for producing amino acids by fer-mentation:Japan,01,317,395 A[P]119891[20] Katsumata R, Ikeda M1Hyperproduction of Tryptophan in Coryne-bacterium glutamicumby pathway engineering[J]1Nature Biotechnology11993, 11: 921-9251[21] Ikeda M, Katsumata R1Hyperproduction of tryptophan by Corynebacteriumglutamicumwith the modified pentose phosphate pathway[J]1Applied and EnvironmentalMicrobiology, 1999, 65: 2497-25021。