造血细胞分离、集落培养及表型分析
所谓造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSC，）是指具有自我更新和多向分化能力的一类细胞。
它的基本特性是具有自我更新能力，即经过一个细胞周期活动之后，可以产生两个与分裂前性质相同的造血干细胞,同时又具有多向分化能力，即在一定的环境条件下，造血干细胞具有向各系血细胞分化的能力。
图1 造血系统和造血干细胞分化图
Fig。
1 hematopoietic system and hematopoietic stem cell differentiation.
造血干细胞主要存在于骨髓、动员的外周血、脐血中，与骨髓和动员的外周血相比，脐血来源丰富、受病毒污染的几率小、富含造血干细胞且所含的造血干细胞具有更高的增殖潜能，同时脐血中的淋巴细胞幼稚，具有较低的免疫排斥活性，是优良的造血干细胞来源。
造血干/祖细胞鉴别的传统方法还是应用集落分析方法，它可检测粒-巨嗜细胞集落形成单位（colony - forming unit-granulocyte/ macrophage，CFU-GM）、红系爆式集落形成单位（burst-forming unit-erythroid，BFU-E）、巨核细胞集落形成单位（colony-forming unit-megakaryocyte，CFU-MK）、红系-粒系-巨嗜系-单核系集落形成单位（multipotent colony-forming units，CFU-GEMM或mixed colony-forming unit，CFU-Mix），等等，它是在半固体培养基上培养14天，然后在显微镜下计数集落。
造血干细胞的表面标志随着个体发育的不同时期不同，CD34+、CD38-、HLA-DR-、Thy-1+、c-kit+、LFA-1-、CD45RA-、CD71-、lin-已经普遍被认为是造血干细胞的标志。
此外，1997年发现一个新的造血干细胞标志是AC133，但具CD34抗原是目前公认的造血干细胞和祖细胞的共同标志。
1、用流式细胞仪分析细胞表型
待测细胞被制成单细胞悬液，经特异性荧光
染料染色后加入样品管中，在气体压力推动下进
入流动室，流动室内充满鞘液，在鞘液的约束下，
细胞排成单列出流动室喷嘴口，并被鞘液包绕形
成细胞液柱。
这种同轴流动的设计，使得样品流
和鞘液流形成的流束始终保持着一种分层鞘流
的状态。
鞘液和样品流组成一个圆形的流束，一起自喷嘴的圆形宝石孔喷射出来，进入流动室，与水平方向的激光光束垂直相交。
该区称为测量区。
利用样品流和鞘流的气压差的层流原理，使细胞依次排列成单行，每个细胞以均等的时间依次通过测量区，被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照射后发出荧光，同时产生散射光。
细胞发出的荧光信号和散射光信号，同时被荧光光电倍增管接收，被积分放大反转换为电子信号输入电子信息接收器、通过计算机快速而精确地将所测数据计算出来，结合多参数分析，从而实现了细胞的定量分析。
2、单个核细胞的分离
采用密度梯度原理，利用血液中各类细胞的密度不同进行分离。
3、CD34+细胞分选
利用抗原抗体反应的原理，样品中的CD34+细胞可与偶联有CD34抗原的磁珠反应，将MiniMACS 免疫磁性吸附柱置于磁场中，未与磁珠结合的CD34-细胞随缓冲液流出，与磁珠结合的CD34＋细胞保留在吸附柱中，将吸附柱移出磁场后用MACS缓冲液冲洗吸附柱即获得纯化的CD34＋细胞。
4、集落检测
利用造血干细胞的特性，在特定的条件下，造血干细胞可向某一系的细胞分化，从而在半固体培养基上形成一个个的克隆，即集落，一个集落代表一个造血干/祖细胞。
脐血
脐血由上海国际和平妇婴保健院提供。
供者要求身体健康，发育良好的非高龄产妇。
无遗传病史，无病毒病史，无血液系统疾病，无寄生虫病及地方病。
HIV、肝炎、梅毒等检测均为阴性。
健康产妇分娩以后，立即用血袋无菌采取新生儿脐带血，血袋内装有无菌ACD－B25mL抗凝剂(每100mLACD－B 含有：一水合枸橼酸0.48g，二水合枸橼酸钠1.32g，一水合葡萄糖1.47g)，相当于100mL的血液抗凝剂，每次实际采集脐带血50-100mL。
采集后脐带血置于4℃冰箱内保存，一般在6小时内取回分离。
培养基与细胞因子
培养基为IMDM培养基，添加20%的胎牛血清。
细胞因子均为人重组蛋白，干细胞因子（SCF）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-3（IL-3）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、红细胞生成素（EPO）、
三、实验方法
单个核细胞的Ficoll密度梯度离心分离
将脐血用IMDM培养基以1：2稀释，在50mL离心管中加入15mL Ficoll，之后小心加入30mL稀释的脐血平铺在Ficoll上，之后置于吊篮式离心机中在400g下密度梯度离心30min，吸取中间的白层，用IMDM培养基洗涤细胞，除去淋巴细胞分离液和血小板。
集落分析方法
CFU－GM的检测体系为IMDM培养基，添加20％胎牛血清，4mmol/mL 谷氨酰胺，含0.9％甲基纤维素，以及人重组造血生长因子SCF、IL-3、IL-6，GM－CSF、G－CSF,其浓度分别为50 ng/mL、20 ng/mL、20 ng/mL、20 ng/mL 和20ng/mL。
半固体培养在24孔板中进行，每孔加半固体培养基500 L，加入2.5×104个单个核细胞。
在37℃、5％CO2、湿度饱和的二氧化碳培养箱中培养14天后在显微镜下进行集落计数，超过50个细胞的细胞簇为一个集落。
流式细胞分析
取1.0×106细胞用PBS洗两遍，重悬后分配到1.5mL管中离心，加PE偶联的小鼠抗人CD34单抗和FITC偶联的小鼠抗人CD45单抗各10 L，4℃孵育30分钟。
PBS洗两遍，离心后，每管加1mL FACS保存液。
同型对照以PE 偶联的小鼠抗真菌毒素标记。
标记细胞用流式细胞仪（BD公司）分析，结果用Lysis II软件处理，以CD45设门进行分析。
脐血CD34＋细胞的分离纯化
将1.0×108细胞悬浮于0.3mlMACS缓冲液中，加50μl偶联于磁珠的小鼠抗人CD34+抗体，4℃孵育30分钟，采用MiniMACS 免疫磁性吸附柱分离装置洗涤吸附柱中进行分离，未与磁珠结合的CD34-细胞随缓冲液流出，与磁珠结合的CD34＋细胞保留在吸附柱中，将吸附柱移出磁场后用MACS缓冲液冲洗吸附柱即获得纯化的CD34＋细胞。
四、实验结果
1、单个核细胞的分离
2、造血干/祖细胞集落计数
3、脐血中CD34+细胞的数量
4、脐血中分离得到的CD34+细胞的数量
五、讨论
1、从一袋血获得的CD34+细胞数与集落形成数之间有和关联？
2、用MiniMACS 免疫磁性吸附柱分离法获得的CD34+细胞数，与流式细胞分析的结果是否一致？若不一致，原因何在？
动物细胞培养、计数、冷冻和复苏
I. 动物细胞的培养和计数
一、实验目的
由动物细胞表达和合成的蛋白质除了具有正确的氨基酸序列之外，在加工过程中还能以正确的方式进行折叠和修饰，且大多能以天然形式分泌到培养基中，从而确保了所生产的蛋白质具有与天然产物一致的生物活性、免疫原性和体内寿命，这些特点使得动物细胞成为工业化生产诊断和治疗用生物产品的理想宿主，如各类重组蛋白质和单克隆抗体等。
另外，目前方兴未艾的组织工程、干细胞工程等也是和细胞培养技术密切相关的，因此，可以说细胞培养技术是细胞工程、组织工程等研究领域的基础。
本实验的目的是让学生学习和了解动物细胞培养的基本操作，以及相关的细胞培养前准备工作、细胞培养的环境条件和其他有关注意事项；用血球计数板对培养瓶中的细胞进行计数以及用台盼蓝计细胞的存活率。
二、基本原理
动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体的细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术，是动物细胞工程的基础。
体外培养可分为原代培养和传代培养，原代培养是指将机体取出的细胞或组织进行实效培养的过程，这样的细胞称为原代细胞，原代细胞通常只能培养10－50代左右即退化死亡；由原代细胞通过变异、分化等手段筛选出来具有无限次代培养能力的细胞群称为细胞系，这类细胞的培养称为传代培养。
体外培养的细胞根据其生长方式，主要可分为贴附型细胞和非贴附型细胞两类，贴附型细胞必须贴附在某一固相表面才能生存和生长，非贴附型细胞可在培养液中悬浮生长，因而也叫悬浮型细胞。
动物细胞培养与微生物培养有很大不同，这主要是因为动物细胞无细胞壁，。