乙肝病毒耐药基因测序的临床应用
◆DNA测序技术原理
◆乙肝耐药基因测序特点 ◆耐药基因测序的应用
DNA测序技术原理
乙肝病毒结构
美国ABI3130型基因测序仪
本实验采用核酸扩增技术结合 荧光标记探针杂交方法对乙型肝炎 病毒DNA进行定量检测，其产物经 过测序PCR反应，产物纯化后上 3130测序仪进行毛细管电泳，得到 测序峰图，从而完成耐药突变位点 的检测。
乙肝治疗的耐药管理
• 耐药也是一个“进化升级”的过程，从初级的“基因变异”，逐渐演 变成中级的“病毒学耐药”，最终修炼成了的“临床耐药”。 • “基因耐药”是指在抗病毒治疗过程中体内乙肝病毒基因组产生了变 异，形成新的耐药性病毒基因序列。在这个初级阶段，变异病毒株在 人体内的含量很少，还属于毫不起眼的“少数派”。由于它们数量稀 少、势力低微，只能通过病毒基因检测才能发现他们的存在。 • 从“基因耐药”阶段跨入“病毒学耐药”阶段的过程中，变异病毒株 会持续不断地进行自我复制，导致血清中HBV DNA水平反弹至 1×103～1×106拷贝/毫升之间，这时尚未造成肝功能异常和明显的 肝脏组织学损伤。
• HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者ห้องสมุดไป่ตู้1、2、3 年时的耐药发生率分别为0%、1.6%、 3.1% • HBeAg阴性者1、2、3年的耐药发生率分 别为0%、3.0%、5.9%~11%
HBV恩替卡韦耐药
• 拉米夫定耐药的病毒株对恩替卡韦敏感性 降低8至30倍； • 发生YMDD变异患者治疗1 年时对恩替卡韦 耐药发生率为5.8%，并出现相关的位点变 异。
基因测序法的准确度与可靠性是其他 方法不可替代的，它是基因耐药检测的 “金标准”。乙肝病毒耐药基因测序结果 能精确指导用药，确保抗病毒治疗取得最 佳疗效。
↑ 204位点（YIDD）
耐药突变位点命名
• 命名体系将HBV聚合酶蛋白划分成4个区域：终蛋白区、 间蛋白区、rt区和RNA酶区，每个区的氨基酸分别计算位 码。rt区起始于高度保守的EDWGPC DEHG位点，包含 344个氨基酸，拉米夫定治疗相关的变异主要发生在该区， 包括rtL180M和rtM204V/I等。新命名体系包括4个部分， 即所属区域、治疗前氨基酸、变异位码和变异氨基酸，如 rtL180M表示变异发生在rt区的180位点，亮氨酸（L）被 蛋氨酸（M）所取代。应当指出的是，发生变异不一定耐 药，只有当变异株成为优势株时才发生耐药。
rtL180M rtM204V/I/S
以上位点，现有测序试剂盒都可以检测。
目前常用的治疗乙肝口服抗病毒核苷类似物 药物有：拉米夫定、替比夫定、阿德福韦、恩替 卡韦四种。但是由于乙型肝炎病毒具有较高的突 变性，一旦乙肝病毒发生耐药突变，将会导致上 述药物治疗无效。研究结果显示，病人在治疗前 就携带有拉米夫定耐药基因的有约26.41%，携带 有阿德福韦耐药基因的有约6.52%。如果治疗之前 就已经携带有这些耐药基因，在不明确的情况下 使用了相关的药物，势必治疗效果较差。所以耐 药基因测序检测不但是疗效考核的重要指标，更 重要的是它是抗病毒药物选择的重要参考依据， 避免盲目用药。
HBV野生型质控的测序峰图
↑ 173位点
↑ 180位点
↑ 181位点
↑ 184位点
↑ 202位点
↑ 204位点
↑ 207位点
↑ 213位点
↑
↑ 215位点
214位点
↑ 236位点
↑ 237位点
↑ 238位点
↑ 250位点
rtM204V/I/S 的几种基因型
↑ 204位点（YMDD）
↑ 204位点（YVDD）
HBV拉米夫定耐药
使用一年、二年、三年、四年的耐药比 率为：15-32%、38%、56%、67% 虽然拉米夫定治疗慢性乙肝疗效显著， 但长期使用拉米夫定会出现耐药现象
一旦出现拉米夫定耐药突变（YMDD变 异），大多数患者会在2-4个月之内出现 HBV-DNA和ALT反弹
HBV阿德福韦耐药
• 阿德福韦为5’-单磷酸脱氧阿糖腺苷类似物， 可明显抑制HBV DNA复制
• 当变异株最终推翻了野生株的统治成功当家作主后，耐药发展到了 “临床耐药”阶段。这时候，乙肝病人血液中的HBV DNA水平会反 弹升至1×106拷贝/毫升以上，最终出现肝功能异常、肝脏组织学损 伤。 • 因此，我们在“病毒学耐药”阶段及“基因耐药”阶段就应该尽早进 行干预，及时阻止“病毒学耐药”朝“临床耐药”的恶性方向发展。
• 对于HBV DNA定量大于等于5×103 IU/ml 的标本，可以通过基因测 序的方法检测耐药位点是否发生突变，从而及时进行耐药管理，指导 用药。
• 对所有接受核苷类药物治疗的慢性乙型肝炎患者，治疗期间都应密切 监测病毒学应答与突破，停药以后也应监测应答持续和病情复发情况
• 对初治无应答的患者，应考虑替换治疗以获得临床应答，尽可能减 少后续耐药。对发生病毒学突破的患者，应考虑其依从性，同时尽可 能进行病毒耐药突变的检测，以确定基因型耐药的存在和病毒耐药突 变的模式。目前越来越多的患者接受一种以上药物治疗，对病毒耐药 突变的检测显得尤其重要。
SAP MIX的作用
外切酶Exon I 降解定量PCR产物中残 留的单链PCR引物。SAP酶除去定量PCR产物 中残存的脱氧核苷三磷酸的磷酸基团，从 而达到纯化定量PCR产物的目的。
经过SAP MIX 酶解纯化后的定量产物方 可以进行后面的测序PCR反应。
测序PCR循环条件
96℃ 1min → (96℃ 10sec , 50℃ 5sec , 60℃ 4min) ×25 cycles →4℃恒温。
rtA181V/T/S rtV214A rtQ215S rtN236T rtP237H rtN/H238T/D
rtT184A/I/S rtS202G/I rtM204V/I/S rtM250L/V
rtL180M rtM204V/I/S
复制DNA序列于NCBI基因分型网页上，就可 得到乙肝病毒基因分型结果。 /projects/gen otyping/formpage.cgi
毛细管电泳原理
一、电进样与电泳 毛细管和电极深入样品溶液中， 加电压，荷负电的DNA分子进入毛 细管，在电场作用下向阳极泳动。
二、荧光激发和检测 带4色荧光标记的DNA片段按分子量 从小到大依次经过激光检测区，激光激 发荧光，产生长波长的荧光信号，荧光 信号被CCD收集，软件将光学信号转换 成电泳图谱。
60℃ 4min的延伸时间是与普通PCR最 大差别，目的是为了扩增出一系列相差一 个碱基的ddNTP末端终止的DNA序列。
测序反应得到的产物经过酒精纯化， 甲酰胺变性之后，可以上机进行毛细管电 泳。
酒精纯化的目的是去除未结合的荧光 染料终止物和残留的引物、盐离子、酶等。 此步对测序成功非常关键，关系到测序峰 图质量的好坏。
乙肝耐药基因测序特点
基因芯片和基因测序方法检测乙肝耐药位点的比较
基因芯片
基因测序
原理
结果 分析
标本DNA与耐药检 双脱氧终止法检测 测探针的DNA杂交 基因序列
由显色结果判断 野生株与突变株 由碱基序列与氨基 酸序列判断
↑ 204位点
由上图204位点可见，存在GTG、ATG、ATT三种碱基排列状况， 分别对应V、M、I三种氨基酸，为YMDD/YVDD/YIDD杂合子，测序结 果直观可靠。
相较于基因芯片检测，基因测序法具有直观，准确的 优点，也避免了DNA杂交可能发生的污染，假阴性，假 阳性问题。对于杂合子，也就是野生型与突变型共存的状 况，更直观可靠。
↑
204位点
由上图204位点可见，有GTG弱势突变株存在，属于YVDD 与野生型共存的状况，基因测序可以较早发现突变株的存在。
乙肝病毒耐药位点检测的临床应用
• 本资料来源于 网址： /Article/ygfz/ygzl/200211/1159.html
上海申友乙肝病毒DNA测序试剂盒检测的 耐药位点
拉米夫定（LAM） 阿德福韦（ADV） 恩替卡韦（ETV) 替比夫定（LDT)
rtV173L rtL180M rtM204V/I/S rtV207I/L/G rtS213T
拉米夫定（LAM） 阿德福韦（ADV） 恩替卡韦（ETV)
替比夫定（LDT)
rtV173L rtL180M rtM204V/I/S rtV207I/L/G rtS213T
rtA181V/T/S rtV214A rtQ215S rtN236T rtP237H rtN/H238T/D
rtT184A/I/S rtS202G/I rtM204V/I/S rtM250L/V
乙肝病毒P区耐药基因测序步骤
• HBV DNA 的提取 • 定量PCR反应 （ HBV DNA ≥ 5×103 IU/ml 的标本可以进行测序） • PCR产物的酶解（SAP酶混合物） • 测序PCR反应 （双脱氧终止法） • 测序产物纯化 （乙醇纯化法） • 上机测序 （毛细管电泳） • 测序峰图分析
双脱氧终止法原理
病毒DNA定量分析得到HBV DNA ≥ 5×103 IU/ml 的标本可以进行后续的耐药基因 测序 ，定量PCR产物经过SAP MIX的纯化后， 进行测序PCR反应。
普通PCR与测序PCR反应的比较
普通PCR DNA 聚合酶 引物 底物 产物 荧光标记 Taq 酶 一对 dNTP 等长的DNA片段 无 测序PCR反应 （双脱氧终止法） 测序酶 单向 dNTP+ddNTP(带荧光 标记) 相差一个碱基的一 系列片段 3’端带荧光标记