1mol/L NaOH（ml）
1%酪蛋白溶液（ml）
8
1
8
0
8
0
迅速摇匀，室温下静置30min
取上清液于275nm波长下测定吸光值
五、结果与讨论
1、计算菠萝蛋白酶得率（g/100g），并计算所得酶制剂的活性（U/g）。
(A2+A3)/2－A1
酶活性= —————————
0.15×1/100×1/10
2、洗涤与保护
（1）酶糊倒入烧杯，加0.1%EDTA溶液100ml，搅匀，再加1.5%NaCl溶液200ml搅匀，4000rpm离心7min，倾去上清液，得酶复合物I；
（2）将酶复合物I倒入烧杯，加0.5%乙酸锌溶液20ml，搅匀，静置5min；加0.06%Vc溶液30ml，搅匀，静置5min；再加1.5%NaCl溶液20ml，搅匀静置5min；最后加0.5%EDTA溶液20ml，搅匀静置5min；以4000rpm离心7min，倾去上清液，得酶复合物II；
四、实验步骤
1、提取
（1）取一定量的菠萝皮汁（约ml），加5%苯甲酸钠10ml，搅匀，以4000rpm离心7min，取上清液倒入另一烧杯中；
（2）缓慢加入0.2%单宁溶液75ml，边加边搅拌约15min，沉淀物析出，静置40min；
（3）虹吸除去上清液，沉淀物以4000rpm离心5min，倾去上清液，得酶糊状物。
4、酶活测定
（1）酶液制备
取所得酶制剂0.15g，加入0.05mol/L（pH7.0）PBS(磷酸盐缓冲液)定容至100ml，过滤。滤液即为工作酶液。
（2）活性测定
取3只试管，按下表加入试剂，及其他操作。（各试剂于37℃水浴保温至恒定）
试剂
管号
1
2
3
酶液（ml）
1%酪蛋白溶液（ml）
1
0
1
1
1
1
混匀，37℃保温10min
（3）将酶复合物II倒入烧杯，加0.5%硫代硫酸钠溶液20ml，搅匀静置5min；加1% L-Cys溶液10ml，搅匀，以4000rpm离心7min，倾去上清液，得菠萝蛋白酶糊。
3、冷冻干燥
将所得酶糊放入冰室（－12℃），冷冻15~20h，取出解冻，离心得酶膏；将其放入装有氯化钙或五氧化二磷的干燥器中干燥6~10h，得干酶，研磨成粉状，低温保存。
2、讨论影响菠萝蛋白酶得率及活性的主要因素。
课后体会：
实训三 菠萝蛋白酶的制备及活力测定
一、目的和要求
1、掌握菠萝蛋白酶制备的基本原理和方法；2、掌握菠萝蛋白酶活测定方法。
二、原理
菠萝蛋白酶具有一定的医疗保健功能：1、抑制肿瘤细胞的生长；2、对心血管疾病的防治；3、用于烧伤脱痂；4、消炎作用；5、增进药物吸收。
单宁又称鞣酸、丹宁酸，是多酚中高度聚合的化合物，它们能与蛋白质（酶）形成难溶于水的复合物，是蛋白沉淀剂。本试验即利用单宁沉淀法提取菠萝蛋白酶。
EDTA、Vc和L－半胱氨酸具有保护酶活功能；锌离子、硫代硫酸钠等具有酶活激活的作用。
活性测定方法是以酪蛋白水解释放的酪氨酸在275nm的吸收值为基础，酶活单位定义为：在测定条件（37±0.2℃；pH值7.0）每分钟水解酪蛋白释出的三氯乙酸可溶物在275nm波长有吸光度与1微克酪氨酸的吸光度相当时，所需的酶量即为一个活力单位，用u/g表示。
第十八、九讲2009～2010学年第一学期
2009年月日第节
授课内容
实训三 菠萝蛋白酶的制备及活力测定
授课时数
4
教学目标
1、掌握菠萝蛋白酶制备的基本原理和方法；2、菠萝蛋白酶活测定方法
教学重点
菠萝蛋白酶提取方法原理和酶活保护措施
教学难点
单宁沉淀蛋白的酶活保持
教材教具
教学内容（含教学步骤、时间分配、教法学法、作业布置等）
三、实验材料
1、
2、器材
100ml量筒、500ml烧杯（2个）、100ml烧杯、玻璃棒、漏斗、纱布、干燥器、离心机、紫外分光光度计。
3、试剂
苯甲酸钠、单宁、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）、NaCl、乙酸锌、抗坏血酸、硫代硫酸钠、L-半胱氨酸、Na2HPO4、NaH2PO4、酪蛋白。