2 细胞的复苏
复温速率 复温速率是指在细胞复苏时温度升高的速度。 一般来说复苏速度越快越好。 常规的做法是，在37℃水浴中，于1～2min内
完成复温。
第六节 动物细胞大量培养的方 法和操作方式
动物细胞大规模培养：
在人工条件下（设定pH、温度、溶氧等）， 在细胞生物反应器（bioreactor）中高密度大 量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。目 前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴 肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、 cho（中华仓鼠卵巢）细胞、BHK-21(仓鼠肾 细胞)、Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞，贴壁 依赖)等。
③结团培养：
利用细胞本身形成结团的特点，相互结团后 再用悬浮的方法培养，操作简便，节省了 用于微载体的成本。
二、动物细胞培养的操作方式
1、分批式操作 将细胞和培养基一次性加入反应器内进行
培养，此后细胞不断增长，产物不断形成 和积累，最后将条件培养基，即经培养已 含有细胞产物的培养基，或连同细胞一并 取出，培养结束。
已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫 疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红 细胞生成素、单克隆抗体等产品。
依细胞种类：原代培养、传代培养
依培养基：液体培养、固体培养
依培养器和方式: 静止培养、旋转培养、搅拌 培养、微载体培养、中空纤维培养、固定 床或流化床培养。
生产实际来看：悬浮培养、贴壁培养和贴壁悬浮培养。
一、动物细胞大规模培养的方法
1、悬浮培养（suspension culture） 让细胞自由的悬浮于培养基内进行生长繁殖。 适用细胞类型：悬浮细胞，兼性贴壁细胞，杂
交瘤 设备：通气搅拌式生物反应器、气升式生物反
应器。 生产药物：单克隆抗体；干扰素。
优点：操作简单，培养条件均一，传质和传 氧效果好，容易大规模培养。借鉴微生物发 酵理论和经验，发挥动物细胞的特性。
80年代以后发展的多孔微载体或多孔微球， 增大了供细胞贴附的比表面积。
应用：工业化生产干扰素、疫苗和尿激酶原
②包埋或微囊培养： 将细胞包埋或包裹在凝胶载体或微囊内。 可用于包埋细胞的载体材料为：人工合成的
高分子聚合物；糖类如纤维素等；蛋白质如 胶原、纤维蛋白等。
包埋法：
将细胞包埋在多孔载体内部制成固定化细胞 的方法。 优点：步骤简单，条件温和，负荷量大，细 胞泄露少，抗机械剪切。
常用的消化液有胰蛋白酶、乙二胺四乙酸、胰酶 －柠檬酸盐、胰酶－EDTA、胶原酶、链霉蛋白酶、 木瓜蛋白酶等。
二 细胞计数
1 血球计数板计数 2 自动细胞计数器计数 3 结晶紫染色细胞核计数法 4 MTT染色计数法
三 细胞传代
1 悬浮细胞的传代
加入一倍或几倍的生长液，然后分种两只或 多只培养瓶即可。
另一种是先将细胞和培养基加入反应器， 待细胞生长至一定密度后，向反应器内加 入诱导剂或病毒等，经一段时间作用后， 将反应物取出。
将悬浮培养和贴壁培养相结合的方法。 ①微载体培养：细胞贴附在载体表面。创造大
的贴附面积，供细胞贴附生长增殖；载体体 积小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细 胞自由地悬浮在培养基内，充分发挥悬浮培 养的一切优点。 载体：葡聚糖、聚苯乙烯、胶原等。
理想的微载体应具备：
生物相容性；无毒性；表面惰性；比重适当 （1.030-1.045g/ml）；粒径均一，在60250m之间（溶胀后）；光学透明；柔软；耐 高压灭菌温度；反复多次使用；制备简单、原 料充分。
第五节 动物细胞培养的基本方法
一 细胞分离
1 离心分离法
用于从含有细胞的体液如血液、羊水、 胸腹水中分离细胞。一般用800～ 1000rpm离心5～10min。
2 消化分离法
先从生物体取来组织块，将其剪碎，并用消化液 将其消化，使组织松散成细胞悬液，然后用缓冲液 洗涤、离心、去除残留的消化液而获得所需的细胞。
2 贴壁细胞的传代
① 消化前需用肉眼或镜下观察需消化的细胞，确认细 胞有无污染；
② 加入消化液量要适当，以摇动时能盖满单层细胞为 度；
③ 消化时间不宜过久，一般在室温下静置2～5min, 当见细胞层出现麻布样网孔时，即可倒去消化液。
④ 终止消化要先倒去消化液，然后加入有血清的培养 基。
⑤ 已培养过的瓶子可再次使用，但一般不要超过 2～3次。
缺点：细胞体积小，且处于悬浮状态，难采 用灌流培养，细胞密度低。
2、贴壁培养
必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培 养方法。 适用细胞类型：贴壁依赖型细胞，兼性贴壁 细胞。 基质要求：具有净阳电荷和高度表面活性。 对微载体而言还要求具有一定电荷密度。
点：
a容易更换培养液，细胞紧密黏附于固相表面， 可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养 液。 b容易采用灌流培养，从而达到提高细胞密度 的目的，因细胞被固定，不需过滤系统。 c当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效 的表达一种产品。
缺点： a操作比较麻烦，需要合适的贴附材料和足够
的面积。 b培养条件不易均一，传质和传氧效果差。 c不能有效地监控细胞的生长。
贴壁培养系统：中空纤维；玻璃珠；微载 体培养。
贴壁培养和悬浮培养的不同之处是在传 代或扩大培养时，常常需要用酶将其从基 质上消化下来。
3、贴壁-悬浮培养，或称假悬浮培养
⑥ 2倍体细胞培养时每次传代必须写上传代次数。 ⑦ 分种数量取决于细胞数和细胞特性，多数细胞分
种以20～30万个/ml,每次1传2或1传3。 ⑧ 传代后一般每天或隔一天换液，每3～5天就要传
代一次。
四 细胞的冻存和复苏
1 细胞的冻存
将细胞放入试管内，在冰浴条件下加入预冷的冰 冻保护剂（二甲基亚砜+山梨醇+甘油+蔗糖）。 密封试管，继续在冰浴中停留15min。然后试管 以1℃/min的速度冷却，降到-40℃，在-40℃停 留2h后投入液氮罐（-196℃）。
包埋法
缺点：扩散限制，并非所有的细胞处于最佳 基质浓度，且大分子基质不能渗透到高聚 物网络内部。
一般适用于非贴壁依赖性细胞的固定。 常用的载体：琼脂糖；海藻酸钙凝胶
微囊法：
用一层亲水的半透膜将细胞包围在珠状的微 囊内，细胞不能溢出，但小分子物质及营 养物质可自由出入半透膜。
囊内是微小培养环境，与液体培养相似，能 保护细胞少受损伤，故细胞生长好、密度 高。