细胞培养技术细胞培养发展史及其应用（一）前言20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。

生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。

1907年，美国生物学家哈里森(Harriso n)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。

蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。

哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。

此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。

所谓动物细胞培养(亦称组织培养)既有别于植物细胞培养，又与微生物的培养完全不同。

所谓动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外人工条件下的生长、增殖过程，在此过程中细胞不再形成组织。

由于动物细胞培养是在人工条件下进行的，便于调控和观察，因而成为现今研究动物的物质代谢过程、染色体的形态变化、以及遗传物质的表达调控等高难领域的既便利而又有效的新方法。

同时，随着现代生物化学、分子生物学、分子遗传学、以及现代医学的发展，细胞培养也在许多应用领域充分展示了其巨大的发展潜力，并已为世人所关注。

尽管如此，动物细胞培养仍是一门年轻的新学科，在发展之初被混淆于动物组织培养之中。

（二）细胞培养技术及其历史细胞培养的历史最早可追溯到19 世纪末，据可考证的资料记载W ilhelm Roux是第一个进行动物组织培养实验的人。

1885年Wilhelm Roux 将鸡胚髓板放置于温热盐水中使之维持存活了数天，是有记录的第一个体外移植成功的例子。

1887年Arnold把恺木的木髓碎片接种到蛙的身上。

当白细胞侵入这些木髓碎片后，他把这些白细胞收集在盛将盐水的小碟中，接下来观察到这些白细胞在运动，并存活了一个短的时间。

1903年，Jolly将蝾螈的白细胞保存在悬滴并维持了十个月。

1906年，Beebe和Ewing在动物的血液中尝试培养了传染性巴肉瘤的细胞。

可是，由于当时的培养基并不理想，因此实验难以重复，并且也难以证明这些先躯者所培养的是否是真正存活的健康的组织和细胞。

结果都和Welhelm ，一样只能维持离体细胞的短期存活,而没有细胞的生长和增殖。

直到1907年，美国胚胎学家Ross Harrison的实验才被公认为组织培养真正开始的标志，因为该实验但提供了可重复的技术，而且证明了生物组织的功能可以在体外十分明确地延续下去。

Ross Harrison将蛙胚神经管区的一片组织移植到蛙的淋巴液凝块中，这片组织在体外不但存活了若干星期，而且居然还从细胞中长出了轴突(神经纤维)，解决了当时关于轴突起源的争论，并表明了利用体外存活的组织进行实验研究的可能性。

他所采用的把培养物放在盖玻分上并倒置于凹玻片腔中的方法还一直沿用至今，称为盖片复盖凹窝玻璃悬滴培养法。

在此基础上，1912年Carrel 则更加丰富和完善了此项技术，他将无菌操作技术引入动物细胞培养，在没有使用抗菌素的条件下使鸡胚心脏细胞在人工培养条件下生存了34年，并且先后传代3400次。

并发现动物体液中存在着对动物细胞生长有强烈促进作用的生长因子。

这一结论早已被现在的研究所证实，并成为无血清培养基研究的基础。

由于这两个人的卓越成就，细胞培养从此开始了迅猛的发展，并成为生物工程特别是细胞工程中一项重要的基础技术.1912年，当时的Carrel是外科医生，在实验中特别注意无菌操作。

他用血浆包埋组织块外加胎汁的培养法，并采用了更新培养基和分离组织的传代措施，从而完善了经典的悬滴培养法（Suspension Cultur e）。

Carrel用这种方法，曾培养一鸡胚心肌组织长达数年之久。

这些创造性的工作充分揭示：离体的动物组织在培养条件下，具有近于无限的生长和繁殖能力；并充分证明组织培养的确是研究活组织和细胞的极好方法。

1924年Maximow又把Carrel的悬滴培养法改良为双盖片培养，使之更易于传代和减少污染。

Carrel又设计了用卡氏瓶培养法，扩大了组织的生存空间。

自悬滴培养问世后的30年中，以Harrlson和Carrel为首的科学家们，用这些方法对各种组织在体外生长的规律和细胞形态进行了深入的研究，发表了大量论文，为组织培养的进一步发展奠定了巩固的基础。

（三）动物细胞的培养方法（1）贴壁培养法大多数动物细胞在离体培养条件下都需要附着在带有适量正电荷的固体或半固体的表面上才能正常生长，并最终在附着表面扩展成单层。

其基本操作过程是：先将采集到的活体动物组织在无菌条件下采用物理(机械分散法) 或化学(酶消化法) 的方法分散成细胞悬液，经过滤、离心、纯化、漂洗后接种到加有适宜培养液的培养皿(瓶、板) 中，再放入二氧化碳培养箱进行培养。

用此法培养的细胞生长良好且易于观察，适于实验室研究。

但贴壁生长的细胞有接触抑制的特性，一旦细胞形成单层,生长就会受到抑制，细胞产量有限。

如要继续培养还需将已形成单层的细胞再分散，稀释后重新接种，然后进行传代培养。

（2）悬浮培养少数动物细胞属于悬浮生长型，这些细胞在离体培养时不需要附着物，悬浮于培养液中即可良好生长，如淋巴细胞和肿瘤细胞。

悬浮生长的细胞其培养和传代都十分简便。

培养时只需将采集到的活体动物组织经分散、过滤、纯化、漂洗后，按一定密度接种于适宜培养液中，置于特定的培养条件下即可良好生长。

传代时不需要再分散，只需按比例稀释后即可继续培养。

此法细胞增殖快、产量高、培养过程简单，是大规模培养动物细胞的理想模式。

但在动物体中只有少数种类的细胞适于悬浮培养。

③大规模培养法动物细胞大规模培养技术是在贴壁培养和悬浮培养的基础上融合了固定化细胞、流式细胞术、填充床、生物反应罐技术以及人工灌流和温和搅拌系统等技术后发展起来的。

始于20 世纪60 年代初Capst ick 及其同事为生产FMD 疫苗而对BHK 细胞的研究。

其后，随着生物技术产品倍受世人亲睐，动物细胞大规模培养技术也随之得到了迅猛发展，并形成了几种比较成熟且有应用价值的大规模培养方法。

①空心纤维法：空心纤维培养法是Richard kncazek 等在1972年创建的。

最初使用的空心纤维是一种由醋酸纤维素和硝酸纤维素混合组成的可透性滤膜，外径约为1/3～3/4mm ，表面具有海绵状多孔结构，既能使水分子、营养物质和气体透过，也能使细胞在上面贴附生长。

这种培养系统的核心部分是由3～6层这样的空心纤维组成的，培养时将待培养细胞接种于空心纤维的外腔，培养一段时间后，当细胞密度达到107-107个/ml时逐渐用无血清培养液代替含血清培养液。

此时细胞虽不再增殖，但能正常生活并继续分泌所需的蛋白质或其他生物制品。

由于这种培养方法在分离和纯化分泌物时很方便，因而在生产激素和单抗时被广泛应用。

并相继开发出了由硅胶、聚砜、聚丙烯等材料构建的新的空心纤维培养系统。

②微载体法：微栽体法是Wezel 在1967 年首先创建的。

所采用的微栽体是由天然葡聚糖聚合物或其他聚合物制成的固体小珠，其直径约在50 微米到数百微米之间。

培养动物细胞时先将微载体在血清中浸泡一下(可加快细胞与微载体的贴附速度) ，然后将制备好的细胞悬液和微载体混合孵育一段时间，待细胞贴附于微载体上后再转移至培养液中培养，并借助温和搅拌系统使细胞随载体均匀悬浮于培养液中。

这样细胞就能够在微载体表面迅速生长、增殖，细胞浓度可高达107个/ml 。

微载体法是一种完全将贴壁培养和悬浮培养融为一体的培养方法。

因而不但能使细胞均匀分布，提高了对培养液和培养空间的利用，而且适于各种细胞的大规模培养，收获过程简单，放大生产也很容易。

因而是一种比较理想的大规模培养方法。

只是此法对微载体的要求较高。

③微囊法:微囊法是美国Damon Biotech 公司创建的一种比较理想的大规模动物细胞培养法。

其基本技术是：先将欲培养的动物细胞悬浮于海藻酸钠溶液中，之后使其通过一种成滴装置(微囊发生器) 而逐滴滴入CaCl2 溶液中，海藻酸钠一旦进入CaCl2 溶液后即形成半透膜微囊，从而将细胞封闭在其内。

然后再将这种包含有细胞的微囊悬浮于培养液中培养。

这样培养液中的水和营养物质可透过半透膜进入微囊供应给细胞,细胞的代谢物也可透过半透膜被排出,而细胞分泌的大分子物质则被阻留而积累与囊内。

当培养一段时间后，在细胞密度达到107/ml时即可分离收集微囊，最后破开微囊就能获得高度纯化的大分子产物。

细胞培养工作中，以下几个方面来预防支原体的污染：①控制环境污染；②严格实验操作；③细胞培养基和器材要保证无菌；④在细胞培养基中加入适量的抗生素。

清除支原体，常用方法有：抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。

支原体最有抑制活性及常用于支原体感染治疗的抗生素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮；其他类抗生素如氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小抑制作用，所以常不用来作为支原体感染的化学治疗剂。

InvivoGen公司研究开发的新一代支原体抗生素M-Plasmocin能有效地杀灭支原体，不影响细胞本身的代谢，并且用M-Plasmocin处理过的培养细胞，不会重新感染支原体。

（四）应用（1）在生物学基础研究中的应用离体培养的动物细胞具有培养条件可人为控制且便于观察检测的特点，因而可广泛应用于生物学领域的基础研究中。

在细胞生物学上，动物细胞培养可用于研究动物的正常或病理细胞的形态、生长发育、细胞营养、代谢以及病变等微观过程。

如神经细胞的增殖、突起生长、相互识别、刺激传递等机理就是通过进行各种神经细胞的培养才弄清楚的。

在遗传学研究中，除可用培养的动物细胞进行染色体分析外，还可结合细胞融合技术建立细胞遗传学进行遗传分析和杂交育种；在胚胎工程中通过体外培养卵母细胞并进行体外受精、胚胎分割和移植已发展成了一种较成熟的技术而应用于家畜的繁殖生产中。

另外，分离和培养具有多潜能性的胚胎干细胞，还可用于动物克隆、细胞诱导分化、动物育种的研究，并可作为基因转移的高效表达载体；在病毒学研究中用培养的动物细胞代替试验动物做斑点分析，不仅方法简便、准确、而且重复性好。

（2）在临床医学上的应用首先，动物细胞培养技术可用于遗传疾病和先天畸型的产前诊断。

目前，人们已经能够用羊膜穿刺技术获得脱落于羊水中的胎儿细胞经培养后进行染色体分析或甲胎蛋白检测即可诊断出胎儿是否患有遗传性疾病或先天畸型，以此可避免先天残疾儿的诞生。

现在用这种方法已能检测出几十种代谢性遗传缺陷疾病和先天畸型疾病。

其次，现在的一些科学研究已能通过染色体对比分析检测出易患癌症的病人，以便进行及早的预防和治疗。

在这方面我国的科学工作者有较突出的研究成果：他们改进了淋巴细胞的培养方法，从而使带有癌基因的人的染色体表现出明显高于常人的畸变率，这就从细胞分子水平揭示了癌症的病理、病因，并为癌症的早期诊断和预防提供了科学依据。