DNA Polymerase
E.coli. DNA聚合酶 聚合酶I 聚合酶 E.coli. DNA聚合酶 大片段 聚合酶I大片段 聚合酶 （Klenow fragment） ） T4噬菌体 噬菌体DNA聚合酶 噬菌体 聚合酶 T7噬菌体 噬菌体DNA聚合酶 噬菌体 聚合酶 耐高温DNA聚合酶： 聚合酶： 耐高温 聚合酶 Taq DNA聚合酶 聚合酶
增和表达的DNA,它们一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒 它们一般是通过改造质粒、 增和表达的 它们一般是通过改造质粒 等构建而成的。 等构建而成的。
质粒
噬菌体
种 类
病毒 组 合 载 体
能在宿主细胞中独立复制; 能在宿主细胞中独立复制 具有多种限制酶的单一切点（ 具有多种限制酶的单一切点（ 多克隆 位点）以便外源DNA插入； 插入； 位点）以便外源 插入
具备条件
必 要 条 件
具有筛选标记,以区别阳性与阴性重组 具有筛选标记 以区别阳性与阴性重组 分子; 分子; 分子较小，便于体外基因操作， 分子较小， 便于体外基因操作，同时 载体DNA与宿主 与宿主DNA便于分离； 便于分离； 载体 与宿主 便于分离
表达载体: 表达载体: 具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、 具有与宿主细胞相适应的启动子、 增强子、 加尾信号等基因表达元件。 加尾信号等基因表达元件。
氯霉素扩增－氯霉素可抑制染
色体DNA复制 色体DNA复制，但质粒复制不受影 DNA复制， 可增加拷贝数。 响，可增加拷贝数。
克隆载体pUC19质粒图谱 克隆载体pUC19质粒图谱 pUC19
克隆载体pBR322质粒图谱 克隆载体pBR322质粒图谱 pBR322
质粒 用于原核宿主的载体 噬菌体 ?
λ噬菌体经过改造去除中间 噬菌体经过改造去除中间 非必需部分可以插入大片 分子（ 段DNA它原因呢？
切除非必需的中央区 λ噬菌体 噬菌体 增减某些限制性酶切位点 插入适当的筛选标记基因 λ噬菌体载体 噬菌体载体
• 置换型载体：适于克隆5-20kb的外 置换型载体：适于克隆 的外 源基因片段识别 部 位序 列 一 般为4、 或 个核苷 般为 、 5或 6个核苷 酸序列； 酸序列； ② 呈双重轴对称。 呈双重轴对称。 EcoR I
性质
切断识别部位或其附近特定部 生两种末 端 位后 ， 产 生两种末端 ， 即 平齐末端和粘性末端（ 突 平齐末端和粘性末端（5’突 出端和3’突出端）。 出端和 突出端） 突出端 Pst I
拷贝/细胞，例如 载体可达700个/细胞 拷贝 细胞，例如pUC载体可达 细胞 载体可达 个 细胞
严紧型－受受体染色体 受受体染色体DNA复制控制，拷 复制控制， 复制控制
贝数低， 几个拷贝 细胞，例如pSC101 几个拷贝/细胞 贝数低，1-几个拷贝 细胞，例如
分类
可转移型 不可转移型* 不可转移型* 兼容型 非兼容型* 非兼容型* 天然型 人工型* 人工型*
CTGC↓AG GA↑CGTC
5’突 突 出
3’突 突 出
特殊的限制酶
同裂酶isoschizomer 同裂酶
指来源不同，但有相同识别序列的限制性内切酶。 指来源不同，但有相同识别序列的限制性内切酶。
同尾酶isocaudamer 同尾酶
指识别序列不同，但切割 指识别序列不同，但切割DNA后可以产生相同粘端 后可以产生相同粘端 的限制性内切酶。 的限制性内切酶。
有
有
ATP
NAD+
粘性末端连接
载体和插入片段具有相同的粘性末端 载体和插入片段具有相同的粘性末端 容易连接成环状的重组DNA DNA分子 容易连接成环状的重组DNA分子 可在连接前， 可在连接前，用碱 可能出现问题： 可能出现问题： • 载体自身环化，造成假阳性背景克隆； 性 磷 酸 酶 将 载 体 载体自身环化，造成假阳性背景克隆； DNA 5’ 端 去 磷 酸 • 插入片段可双向插入； 插入片段可双向插入 双向插入； 化，这样只有载体 • 插入片段可多拷贝插入。 插入片段可多拷贝插入 多拷贝插入。 和插入片段之间才 能发生连接； 能发生连接； DNA片段两端为 片段两端为非同源的粘性末端 当DNA片段两端为非同源的粘性末端 可实现定向克隆，连接效率高， 可实现定向克隆，连接效率高，简捷
常用克隆载体
质粒 λ噬菌体 Cosmid 真核病毒 YAC, BAC
1、什么是质粒? 什么是质粒? 2、质粒作为基因工程载体的原因? 质粒作为基因工程载体的原因? 3、质粒的分类?基因工程使用的质粒的特点? 质粒的分类?基因工程使用的质粒的特点?
松弛型* 独立复制，拷贝数高, 松弛型*－独立复制，拷贝数高 10-200个 个
修饰酶
Reverse Transcriptase 细菌碱性磷酸酶BAP 细菌碱性磷酸酶 牛小肠碱性磷酸酶CIP 牛小肠碱性磷酸酶
Alkalinephosphatase
T4 Polymerase Kinase
载 体
载体(vector)是能够携带外源DNA进入宿主细胞进行扩 载体(vector)是能够携带外源 进入宿主细胞进行扩
利 用 磷 酸 酶 防 止 载 体 DNA 的 重 新 环 化
质粒载体的定向克隆
。
基因工程常用工具酶 限制性内切酶
作
用
识别DNA特定序列，切割DNA链 特定序列，切割 识别 特定序列 链
DNA聚合酶 或大片段 1、切口平移制作标记 聚合酶I或大片段 、切口平移制作标记DNA探针；2、合成 探针； 、合成cDNA第二 聚合酶 探针 第二 Klenow fragment 条链；3、填补双链 凹端； 、 条链； 、填补双链DNA3’凹端；4、DNA序列分析 凹端 序列分析 DNA连接酶 连接酶 Taq DNA聚合酶 聚合酶 逆转录酶 T4多核苷酸激酶 多核苷酸激酶 末端转移酶 S1核酸酶、绿豆核酸 核酸酶、 核酸酶 酶 DNA端酶 端酶I 端酶 RNA酶A 酶 磷酸酶 连接两个DNA分子或片断 分子或片断 连接两个 聚合酶链式反应（ 聚合酶链式反应（PCR） ） 合成cDNA第一条链 合成cDNA第一条链 催化多核苷酸5’羟基末端磷酸化， 催化多核苷酸 羟基末端磷酸化，制备末端标记探针 羟基末端磷酸化 在3’ 末端加入同质多聚物尾 降解单链DNA或RNA，使双链DNA突出段变为平端 降解单链 或 ，使双链 突出段变为平端 降解DNA，在双链DNA上产生随机缺口 ，在双链 降解 上产生随机缺口 降解除RNA 降解除 切除核酸末端磷酸基
+ 检
工具酶
修饰酶 连接酶 限制性内切酶
DNA聚合酶 聚合酶 DNA Polymerase 逆转录酶 Reverse Transcriptase 碱性磷酸酶 Alkalinephosphatase T4多核苷酸酶 多核苷酸酶 T4 Polymerase Kinase
限制性内切酶 活性定义
限制酶的一个活性单位（ ） 限制酶的一个活性单位（1U），原则 上是在50µl的反应液中，37℃的温 的反应液中， ℃ 上是在 的反应液中 度条件下，经过1小时反应，将 1µgDNA完全分解所需要的酶量。 完全分解所需要的酶量。 完全分解所需要的酶量
双元载体系统
克隆载体：以繁殖DNA为目的的载体， DNA为目的的载体 克隆载体：以繁殖DNA为目的的载体，通常
分类
分子较小，自我复制能力强，拷贝数高。 分子较小，自我复ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ能力强，拷贝数高。如 pBR322、pUC、M13等 pBR322、pUC、M13等。
表达载体： 表达载体：以获得基因表达产物为目的的载
体，通常要具有强启动子、结构稳定、拷贝数 通常要具有强启动子、结构稳定、 高和能在宿主细胞中高效表达等特点。 高和能在宿主细胞中高效表达等特点。
第四章 分子生物学的研究方法
一、重组DNA技术 重组DNA DNA技术
1973年 以DNA重组实验成功为标志 年 重组实验成功为标志 遗传物质是DNA 遗传物质是 DNA双螺旋结构 双螺旋结构 遗传信息传递方式 工具酶 载体 转录酶
理论上三大发现 现代分子生物学 技术上三大发明
跨越天然物种屏障 定向创造新物种
λ噬菌体载体 噬菌体载体
• 插入型载体：允许插入5-7kb的外 插入建 λgt 噬菌体载体。 噬菌体载体。
科斯质粒 (Cosmid)
粘粒、 粘粒、柯斯质粒 是指含有λ噬菌体粘性末端的杂种质粒，由 λDNA的COS区(约20-数百 数百bp)与质粒重组而 的 区 约 数百 与质粒重组而 成，在宿主细胞中可作为正常噬菌体进行复 但不表达任何噬菌体的功能。 制，但不表达任何噬菌体的功能。可以克隆 40-50Kb的外源 的外源DNA片段。 片段。 的外源 片段
Ti质粒的功能组件： 质粒的功能组件： 质粒的功能组件
T-DNA
T-DNA特点： DNA特点： 特点 • 可自发转移，并整合进植物基因组； 可自发转移，并整合进植物基因组； • 导致冠瘿瘤形成，控制冠瘿碱合成； 导致冠瘿瘤形成，控制冠瘿碱合成； • 长度 长度12-24Kb。 。
共整合载体系统
由Ti质粒衍生出的载体系统 质粒衍生出的载体系统
Ti 质粒
---天然载体系统 ---天然载体系统
土壤脓杆菌—植物病原菌— 质粒感染 质粒感染— 土壤脓杆菌—植物病原菌—Ti质粒感染—冠瘿瘤
基因导入
天然载体系统：土壤脓杆菌（ 质粒 质粒） 天然载体系统：土壤脓杆菌（Ti质粒） 发根脓杆菌（ 质粒 质粒） 发根脓杆菌（Ri质粒） 人工导入技术：基因枪、高压、激光、 人工导入技术：基因枪、高压、激光、 人工介导等
穿梭载体：带有两种复制原点，在原核细胞 穿梭载体：带有两种复制原点，
和真核细胞中都能繁殖的载体， 和真核细胞中都能繁殖的载体，通常用于真 核基因的克隆。 核基因的克隆。
克隆载体的特性
• • • • 复制起始： 复制起始：在受体细胞中独立复制 多克隆位点： 多克隆位点：含多个限制性核酸内切酶单一切点 多选择标记：抗药性， 多选择标记：抗药性，其他遗传标记 分子量小：能容纳的外源DNA DNA片段尽可能大 分子量小：能容纳的外源DNA片段尽可能大