(此文档为word格式，下载后您可任意编辑修改！) 生物工程工艺综合性实验报告院（系）：城市建设学院专业班级：生物工程1101学生姓名：马雪文学号：指导教师：李世杰20 14 年 5 月 26 日至20 14 年 6 月 15 日发酵工艺综合性实验指导书一、实验目的微生物发酵技术是生物工程最核心的技术，微生物发酵按其对氧的需求可分为好氧微生物发酵，和厌氧微生物发酵。
好氧和厌氧发酵有较大的区别，各自对工艺条件、发酵设备有不同的要求。
分别掌握好氧和厌氧发酵技术也就比较全面的掌握了工业微生物技术。
本实验分别开出典型的好氧和厌氧发酵实验，训练学生掌握这两种工艺的基本技术、操作程序、分析手段，全面锻炼同学们实际动手能力。
巩固和提高微生物净化操作能力、显微观察技术、培养基配制和灭菌技术、无菌取样和细胞量的确定、生长曲线的制作、光谱分析技术、气象色谱分析技术。
初步培养同学们工业微生物领域科学研究和技术开发的基本能力。
二、实验原理红曲霉通过有氧发酵将淀粉质原料转化为次级代谢产物红曲色素。
丙丁梭状芽孢杆菌经厌氧发酵将农副产品转化为丁醇和丙酮。
三、实验内容1、好氧实验：红曲的发酵实验及其抑菌作用研究2、厌氧实验：丁醇的发酵实验及其气相色谱检测四、仪器设备和试剂、消耗品：1．仪器设备：电子分析天平手提式蒸汽灭菌锅、自动控制蒸汽灭菌锅双孔水浴锅1000W电炉 5台生物显微镜、电脑成像生物显微镜生物培养箱、培养摇床真空干燥箱紫外可见分光光度计离心机真空泵、真空干燥器蒸发器气象色谱仪2．药品和耗材：药品：可溶淀粉 1瓶（500克），蛋白胨 1瓶（500克），琼脂，饴糖（麦芽汁）麦芽1000克，大米粉 5公斤，硝酸钠NaNO31瓶（500克），磷酸二氢钾KH2PO41瓶（500克），磷酸氢二钾K2HPO41瓶，硫酸镁MgSO4·7H2O 1瓶（500克）,硫酸铵(NH4)2SO41瓶，氯化锰MnCL21瓶，硫酸锰MnSO4·H2O 1瓶，碳酸钙CaCO31瓶，维生素B1(盐酸硫胺素)1小瓶，酵母膏1瓶，乳酸（液态1瓶500克），葡萄糖（分析纯）1瓶，乙醇（分析纯）5瓶(5×500克)，乙醇(色谱纯Aladdin) 2瓶,丁醇（色谱纯Aladdin）2瓶，丙酮（色谱纯Aladdin）2瓶，叔戊醇（色谱纯Aladdin）2瓶耗材：500ml三角瓶50只， 250ml三角瓶16个，100ml粗口径试管50只，1000ml烧杯10个，培养皿160套，常规试管160个，200ml烧杯16个，1ml移液枪头5盒，标签纸若干，玻璃真空干燥器大号1个，波美计8只，移液枪（1000ml）2只，玻璃珠2盒，100ml量筒8个，500ml量筒2个，称量纸2盒，不锈钢试剂勺4根， pH试纸2包，玻璃棒若干，玻璃推棒32根，5ml移液管16只五、实验方法步骤和具体操作过程（一）红曲的发酵实验及其抑菌作用研究红曲是一种具有一定营养和药理作用的纯天然红色素，可赋予肉制品、食品、饮料等鲜艳的色泽及特殊风味，而且具有较好的营养价值和一定的防腐作用，因而被广泛地应用于食品工业。
红曲是由红曲霉经发酵分泌到胞外的一种色素，发酵的主要原料是淀粉类如大米、薯类等。
红曲霉发酵合成色素同时对有害菌产生抑制作用。
本实验分为两个部分，前一部分为红曲的发酵实验，后一部分为红曲的抑菌试验。
（Ⅰ）红曲的发酵实验1．菌种本实验室保藏的红曲霉菌种monascus purpureus。
用本实验室自主设计的保藏方法，在短梗霉多糖膜片中封存，置于冰箱中保藏。
使用时每取出一片，进行活化，然后作为种子扩大培养。
2．培养基①斜面试管和平板培养基：饴糖培养基：6～8。
Bx饴糖100 mL，可溶淀粉5 g，蛋白胨3 g，琼脂2 g，121℃灭菌30。
每大组制备200ml用于制作平皿用于菌种活化则不加琼脂，100ml饴糖培养基装入500ml三角瓶中（加入一定数量的玻璃珠）121℃灭菌30分钟备用*饴糖（麦芽汁）的制备：大麦芽50克，粉碎后加入4倍于麦芽重量的水，搅拌均匀，在55℃至60℃的保温箱中糖化4小时，取出过滤得麦芽汁，测波美度，灭菌备用。
以上麦芽汁的制备分为四个大组进行实验，每大组做2瓶试样，②种子培养基为：大米粉3% ，硝酸钠O.5% ，KH2PO40.15% ， MgSO40.1% , 250ml三角瓶中装量100ml，pH6.0乳酸调（加入一定数量的玻璃珠），121℃灭菌30分钟备用（或可溶性淀粉3g，硝酸钠0.3g，黄豆饼粉0.5g，水100ml “微生物学实验”胡开辉）每小组做一瓶③发酵培养基为：a.大米粉9% ，硝酸钠O.2% ，KH2PO40.1%， MgSO40.2% ，pH6.0乳酸调b.小麦粉9% ，硝酸钠O.2% ，KH2PO40.1%， MgSO40.2% ，pH6.0乳酸调c.玉米粉9% ，硝酸钠O.2% ，KH2PO40.1%， MgSO40.2% ，pH6.0乳酸调d.木薯粉9% ，硝酸钠O.2% ，KH2PO40.1%， MgSO40.2% ，pH6.0乳酸调e.土豆粉9% ，硝酸钠O.2% ，KH2PO40.1%， MgSO40.2% ，pH6.0乳酸调f.称取100g籼米热水浸泡1小时，沥干，入玻杯中，灭菌锅中蒸30分钟，冷却后接入种子液，摇匀，培养3～5天，米粒呈紫红色（胡开辉）*分为四大组，每组一个配方进行实验，配方e.、f.作为自选项3．菌种活化在净化操作台上操作。
保藏于短梗霉多糖薄膜的保藏片，用灭过菌的剪刀将其外包装塑料膜剪开，再用灭过菌的镊子将里面的短梗霉多糖膜片夹出，置于装有100ml饴糖培养基的500ml三角瓶中，在恒温摇床上(28士1)℃，以200转速度震荡培养3天左右至瓶中浑浊有颜色变化有孢子生成（以上有教师作预备试验）4．平板单菌落超净工作台擦拭干净，打开紫外灯提前灭菌15分钟至20分钟。
准备9个平皿、玻棒、推棒、1ml移液吸管头1包、9只试管分别装9ml生理盐水，包扎灭菌（121℃,30分钟）好，放入净化操作台备用。
（2人一组）配制加有琼脂的饴糖培养基200ml，三角瓶中灭菌好（121℃,30分钟），放入净化操作台，待培养基冷却至50℃左右，将其分别平均倒入9个平皿中，待其冷却凝固。
（操作前先点燃酒精灯，开启微风，倒平皿时要在酒精火焰的下风口进行操作，倒平皿速度要较快，否则琼脂凝固就会倒不出来）将三角瓶中活化好的红曲孢子，用移液枪吸取1ml，放入其中1只装有9ml 生理盐水的试管中，玻棒搅打均匀。
再用移液枪吸取上述试管中的液体1ml放入装有9ml净化水的试管2中，依此类推，逐步稀释，至第9只试管。
将上述试管中的第3、第4、第5、第6、第7，五只试管中稀释的孢子各吸取0.2ml，涂布在已经凝固好的平板上。
从最稀的第7只开始涂布，到较浓的第3只。
以玻棒推平，同样也是从最稀的开始逐个推平。
置于恒温培养箱中28℃培养至明显的单个菌落出现且能观察到孢子生成。
5．种子培养配制种子培养基②（加入一定数量的玻璃珠）121℃灭菌30分钟（2人一组），放入无菌操作台，待其冷却至常温，将上述平皿上长出的单个菌落上的红曲孢子挑取一环接入三角瓶种子培养基中（250ml三角瓶装量100ml，每组2瓶，其中一瓶用于取样观察，另一瓶则不取样留作种子），放置培养摇床上28℃～30℃，200rpm转速培养，每日在超净工作台上取样观察，至有较多的菌丝生成，将转速调整到160rpm，待有孢子生成即可作为种子。
6．发酵培养（事先将1ml吸管头包扎灭菌备用）分为4大组（每大组做4瓶），分别配制大米粉培养基、小麦粉培养基、玉米粉培养基、木薯粉培养基，500ml三角瓶装量100ml，121℃灭菌30分钟，放入无菌操作台待冷却至常温。
在超净工作台上将上述培养好的种子培养液用移液枪吸取2ml，接种于已灭菌好的发酵培养基中，置于培养摇床上28℃～30℃，200rpm转速进行培养，每日取样观察。
7．取样检测①将三角瓶从摇床中取出，置于超净工作台上（超净工作台事先擦拭干净，紫外灭菌15分钟），点燃酒精灯，开微风，用事先灭过菌的移液枪头吸取1ml发酵液，置于1ml的离心管中；（接种后也要立即取样，作为第一天的检测数据）②在离心机中以3000rpm离心10min，离心机停止转动后立即将上清液倒入一只试管中，加入10ml去离子水稀释；③上述稀释液进一步适当稀释后，用紫外可见分光光度计505纳米处测其吸光值（去离子水作为空白对照），吸光度＝测定值×稀释倍数，作好记录；④离心管下部沉淀物置于真空干燥箱中，抽真空，60℃干燥3小时，电子天平称重，作好记录⑤5天后停止取样，记录每天取样检测结果8．整理每天观察和检测得到的数据①以时间数据为横坐标，离心沉淀物干重为纵坐标作红曲的生长曲线；②以时间数据为横坐标，相应每天得到的红曲吸光度为纵坐标，做红曲色素的生成曲线。
（Ⅱ）红曲的抑菌作用实验1．大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的培养①菌种：大肠杆菌E．coli和金黄色葡萄球菌S．aureus 斜面菌种各一只,本实验室保藏，从冰箱中取出备用。
②培养基：LB培养基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaC1 10g，自来水1000 mL，pH 7．2。
配制50ml装于250ml三角瓶中，各2瓶，121℃灭菌20分钟，冷却至常温备用。
（或蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，葡萄糖10g，NaC1 5g，自来水1000 mL，pH 7．0 中国工业微生物菌种目录培养基32）③种子培养：将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌斜面菌种分别接种于上述LB培养液中，37 ℃培养36 ，去上清液，用无菌水洗涤3次，将所得菌体加10 mL的无菌水稀释。
以无菌水做空白对照用可见分光光度计分别在600 nm和640 nm处测菌悬液的比浊度，除以不含红曲色素培养液培养的菌悬液的比浊度，计算抑菌率。
抑菌率＝（空白培养液浊度－含红曲培养液浊度）÷空白培养液浊度c.以红曲的添加量为横坐标，抑菌率为纵坐标，作红曲的抑菌曲线图。
注：以上实验作两轮,直到得到满意结果，大约需15天左右，为使实验保持连续性，星期六和星期天可能不休息。
（二）丁醇的发酵实验及其气相色谱检测丁醇是由淀粉质原料经丙酮丁醇梭状芽胞杆菌发酵转化得到的一种有广泛用途的化工原料。
它可以作各种涂料的溶剂，比如飞机涂料的最理想溶剂。
生物丁醇与乙醇相似,是生物加工的醇类燃料。
汽油中的主要组成是C6 ～C8 ,因此丁醇比乙醇更类似于"油" , 丁醇与乙醇相比也具有较高的能量密度，它与燃料添加剂和润滑油配伍性更好。
同时,因其类似烃类的结构,丁醇不易于与水相混合,可在炼油厂调合和用管道运送, 无须在分销终端进行调合，同时可调入更高浓度,无需改造汽车。