经甘露醇处理 2 ml 2 ml 2 ml 4 ml 沸水浴中显色 45min 冷却后加入 4 ml 甲苯
未经甘露醇处理 2 ml 2 ml 2 ml 4 ml
旋涡混合仪上振 0.5 min 静置分层，吸取红色甲苯相 波长 520 nm 测定 OD 值 测定对象 OD520 脯氨酸浓度 经甘露醇处理 未经甘露醇处理
实验十二
渗透胁迫与脯氨酸积累
【实验目的】
了解植物体内水分亏缺与脯氨酸积累的关系
【实验原理】
脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，具有很强的水合能力，其水溶液具有很高的水势。脯氨酸的疏水端可 和蛋白质结合， 亲水端可与水分子结合， 蛋白质可借助脯氨酸束缚更多的水， 从而防止渗透胁迫条件 下蛋白质的脱水变性。因此，脯氨酸在植物的渗透调节中起重要作用，而且即使在含水量很低的细胞内， 脯氨酸溶液仍能提供足够的自由水，以维持正常的生命活动。正常情况下，植物体内脯氨酸含量并不高， 但遭受水分、盐分等胁迫时体内的脯氨酸含量往往增加，它在一定程度上反映植物受环境水分和盐度胁迫 的情况，以及植物对水分和盐分胁迫的忍耐及抵抗能力。 植物体内脯氨酸的含量可用酸性茚三酮法测定。在酸性条件下，脯氨酸和茚三酮反应生成稳定的红色 产物，该产物在 520nm 有一最大吸收峰，其色度与含量正相关，可用分光光度法测定。该反应具有较强的 专一性，酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮试剂形成有色产物， 碱性氨基酸对这一反应有干扰， 但加 入人造沸石，在 pH1~7 范围内振荡溶液可除去这些干扰的氨基酸（如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨 酸，精氨酸等 2-氨基的氨基酸）。
加入项 材料[地上部（芽鞘和叶子）] 材料实际质量 3%磺基水杨酸
经甘露醇处理 0.5 g 5 ml 研磨提取未来自甘露醇处理 0.5 g 5 ml
匀浆移至离心管中，在沸水浴中提取 10 min 冷却后，3000 r/min 离心 10 min 取上清液待测
加入项 对应反应液 3%磺基水杨酸 冰醋酸 2.5%茚三酮
3)
取地上部（芽鞘和叶子）0.5 g，用 3%磺基水杨酸 5 ml 研磨提取，匀浆移至离心管中，在沸水浴中提 取 10 min，冷却后，3000 r/min 离心 10 min，取上清液待测。另取未经甘露醇处理的材料同样制得提 取液待测。
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4)
各取 2 ml 两种上清液，分别加入 2ml 蒸馏水，2 ml 冰醋酸和 4 ml 2.5%酸性茚三酮试剂，置沸水浴中 显色 45min，冷却后加入 4 ml 甲苯盖好盖子于旋涡混合仪上振 0.5 min，静置分层，吸取红色甲苯相， 于波长 520 nm 测定 OD 值，最后从标准曲线查得脯氨酸含量。
加入项 10μg/ml 脯氨酸 去离子水
0μg/ml 标准液 0ml 5 ml
2μg/ml 标准液 1 ml 4 ml
4μg/ml 标准液 2 ml 3 ml
6μg/ml 标准液 3 ml 2 ml
8μg/ml 标准液 4 ml 1 ml
加入项 对应标准液 3%磺基水杨酸 冰醋酸 2.5%茚三酮
0μg/ml 显色液 2 ml 2 ml 2 ml 4 ml
【器材与试剂】

实验仪器
可见光分光光度计，低速离心机，水浴锅，旋涡仪，研钵，烧杯，移液管，容量瓶，
具塞试管，冰醋酸，人造沸石。
实验试剂
冰醋酸，甲苯，3% 磺基水杨酸，0.3 mol/L 甘露醇（54.65g 甘露醇溶于 1000 ml 蒸馏
水中），10μg/ml 标准脯氨酸溶液（1mg 脯氨酸溶于 100 ml 80%乙醇中，浓度为 10μg/ml），酸性茚 三酮试剂[2.5 g 茚三酮置于 60 ml 冰醋酸和 40 ml 6 mol/L 磷酸中（见附录表 1），加热（70℃）溶解。 试剂 24 h 内稳定]。
实验材料
小麦种子
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【实验步骤】
1) 取小麦种子于 25℃室温中黑暗浸泡 6 h，播于铺有湿滤纸的培养皿中于室温中黑暗培养。露白后于尼 龙网架上，用水培养 24 h，一组移至 0.3 mol/L 甘露醇中进行培养，另一组仍留在水中继续培养。在 甘露醇中培养至第 3~4 d 的幼苗，取地上部分用作实验材料。培养的时间越长，积累的脯氨酸也愈多， 胁迫效果也愈明显。
2μg/ml 显色液 2 ml 2 ml 2 ml 4 ml
4μg/ml 显色液 2 ml 2 ml 2 ml 4 ml
6μg/ml 显色液 2 ml 2 ml 2 ml 4 ml
8μg/ml 显色液 2 ml 2 ml 2 ml 4 ml
沸水浴中显色 45min 冷却后加入 4 ml 甲苯 旋涡混合仪上振 0.5 min 静置分层，吸取红色甲苯相 波长 520 nm 测定 OD 值 脯氨酸浓度 OD520 0μg/ml 2μg/ml 4μg/ml 6μg/ml 8μg/ml
【注意事项】
一般在处理 24 h 即已显现脯氨酸含量增加，处理的时间越长，则效果愈显著。
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【实验结果及计算】
C V
脯氨酸含量（μg/g FW）=
W
A 100
式中：C ＝从标准曲线上查得脯氨酸微克数； V ＝提取液总体积（毫升）； A ＝测定时取用提取液毫升数； W ＝样品干重（克）。 样品中脯氨酸含量用 μg/g FW 表示。
2)
制作标准曲线：用 10μg/ml 脯氨酸配制成 0、2、4、6、8μg/ml 的标准溶液。取标准溶液各 2 ml，加 2 ml 3%磺基水杨酸，2 ml 冰醋酸和 4 ml 2.5%酸性茚三酮试剂于具塞试管中，置沸水浴中显色 45min， 冷却后加入 4 ml 甲苯盖好盖子于旋涡混合仪上振 0.5 min， 静置分层， 吸取红色甲苯相， 于波长 520 nm 测定 OD 值，以 OD 值为纵坐标，脯氨酸浓度(μg/ml)为横坐标绘制标准曲线。
【思考题】
(1)根据实验结果，分析干旱或盐分胁迫与植物体内游离脯氨酸积累之间有何关系？
(2)为什么用茚三酮作显色剂要在酸性条件下起反应？目的是什么？
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