４６４生物化学与生物物理进展Ｐｍ昏Ｂｉｏｃｌｌ哪．Ｂｊｏｐｈｙｓ．２００４；３ｌ（５）鼻咽癌相关基因ＮＡＰｌ的克隆及鉴定＋李峰蒋卫红杨旭字尹志华冯湘玲刘卫东王磊周文姚开泰”（中南大学湘雅医学院肿瘤研究所，长沙４ｉ００７８摘要从ｕｎ，ｃｃｎｅ库中选取编号为Ｂ（；２３１１９７，来自人鼻咽组织的ＥｓＴ序列．利用Ｂ１ａｓ【检索ｃｅｎＢ蛐ｋ的ｎｒ数据库和ＥｓＴ数据库，构建ＥｓＴ重叠群利用人类基因组草图搜索法从成人正常鼻叫组织中ＰｃＲ扩增获得该基因全长ｃＤＮＡ，命名为ＮＡＰｌ．ＧｅｎＢａｎｋ臀录号为ＡＹｌ９０３２６ＮＡＰｌ基因ｃＤＮＡ序列全长为５７３ｂｐ，编码由８５个氨基酸组成，相对分了质量为９７００的多肽．用ａ一”Ｐ・ｄｃＴＰ标记ＮＡＰｌ基因片段，与含１５种正常成人组织的多组织ＲＮＡ印迹膜杂交，结果表明ＮＡＰｌ基因在淋巴结和气管中高表达，转录本大小约为０．６ｋｂ，在其他组织中小表达ＮＡＩ’ｌ蛋白质与滤泡树突状细胞（川ｌｉｃｕｌａｒｄｅｎｄ—ｔ・ｃｃｅｌｌ，ＦＤｃ）的一种分泌肽前体（ＦＤｃ—ｓＰ）（ＡＦ４３５０８０）同源．与其他已知蛋白质无明显同源性．ＮＡＰｌ基因定位在染色体４ｑ１３，基因组跨越９１７９ｂｐ，含５个外显子和４个内含子．采用差异ＲＴ—ＰｃＲ检测ｒ４０例经病理诊断为低分化鳞状Ｌ皮癌的鼻咽活检组织及其对侧相应部位的正伟鼻咽组织中该蕞周的表达差异在４（）例鼻咽癌中，ＮＡＰｌ基因表达下调的有１７例（４２５％），表达上调的有６例（１５％），无明显表达筹异的有１７倒（４２５％）原位杂交和免疫组化结果显示该基因在正常鼻咽和鼻ｕ困癌组织间质巾的树突状细胞中表达，在其他问质细胞和鼻咽上皮中均不表达以上结果表明，、ＡＰｌ为树突状细胞的一种新的多肽，该基因在鼻咽癌组织巾表达下调的原因，及其与鼻咽癌发生、发展的关系值得进一步探讨关键词鼻咽痹，ＮＡＰｌ基因，基因克隆，鉴定学科分类号。
７８６鼻咽癌（ｎａｓｏｐｈ８ｒｙｎ舭ａｌｃａⅣｊｎｏｍａ，ＮＰｃ）足我国南与‘及东南亚地区常见的肿瘤之一流行病学调查显示，鼻咽癌的发生涉及到遗传倾向性和环境致癌因素，很可能是遗传易感性个体．接受ｒ致癌物的作用而发生的．１９８２年，根据湖南省鼻咽癌死亡率的年龄分布，姚开泰教授提出鼻咽癌发病的三击多步假说”。
，认为ＥＢ病毒（ＥＢＶ）、化学致癌物和胚性击中（即遗传因素或自发突变）构成ＮＰｃ的主要病因，而发病阶段至少在二个以上．但迄今为止，鼻咽癌的具体发病机制仍不十分清楚．因此，鼻咽癌相关基因的克隆及其功能研究有着重要意义．最近，我们从Ｌｎｉｇｅｎｅ库中选取一条编号为Ｂｃ２３１１９７来自人鼻咽组织的ＥｓＴ序列．研究发现该ＥｓＴ序列是－个代表新基因的未知序列我们利用人类基因组草图搜索法”从成人正常鼻咽组织中ＰｃＲ扩增获得该基因全长ｃＤＮＡ，并对该基因进行了牛物信息学分析．采用差异ＲＴ—ＰｃＲ检测了该基囚在经病理诊断为低分化鳞状上皮癌的鼻咽活柃组织和列应的鼻咽癌变对侧正常鼻咽组织巾的表达差芹，并对该基因的表达特征进行了研究．１材料与方法１．１材料５０×Ａｄｖａｎｔ８９ｅ２ＤＮＡ聚合酶混合物购自ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司．ＰｃＲ扩增引物的合成和ＰｃＲ产物测序由上海博亚生物技术有限公司完成．电泳试剂、ＬＢ培养基、ｐｕｃｍ．Ｔ载体均购白上海生工生物技术服务有限公司．随机引物标记盒、ＤＮＡ纯化试剂盒购自美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司，ＴＲＩｚｏｌ。
”试剂盒（ＧＩＢｃ０Ｌ／ＢＲＬ公司）、ｄＮＴＰ为Ｐｍｍｅｇａ公刮产品．ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍ８９ａ公司）．鼠抗人ｓｌｏｏ、鼠抗人ｃＤ２０、鼠抗人ＣＤ６８、鼠抗人ｃＤ５７、鼠抗人ｃＤ３单克隆抗体为ｚｖｍｅｄ公司产品．Ｍｕｌ【ｉｐｌｅＴｉｓｓｕｅＮｏｒ【ｈｅｍ（ＭＴＮｍ）Ｂ１０ｔｓ（Ｃａｔ．７７６０一１，Ｃａｔ．７７６７—１）．Ｄ咄１）ＮＡｂｂｅ儿ｉ“ｇａｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ为ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＧｒｎｂＨ公司产品．’国家重点基础研究发展规＃４项日（９７３）（ｃ１９９８０５１２００”通讯联系人ｎｌ：０７３ｌ－４３６００９４．Ｅ－ｎｌａＩｌ：ｋｔｖａｏ＠‰叫ｌ¨删收稿口期：２００３一ｌｌ＿２４，接受日期：２００４旬ｌ一１８生物化学与生物物理进展Ｐｒ馏，Ｂｉｏｃｈ咖．Ｂｊｏｐｂ胯，４０例来自湘雅医院耳鼻喉科门诊，经病理诊断为低分化鳞状上皮癌的鼻咽活检组织及其财侧相应部位的正常鼻咽组蛰ｌ，组织石蜡块来自湘雅医院病理科．１．２方法Ｉ．２．１ＧｅｎＢａｎｋ数据库检索和ＥｓＴ序列拼接：将ＥｓＴ序列ＨＧ２３ｌＪ９７（种子序列）采用Ｂｌａｓｔ软件进行ＧｅｎＢａｎｋ的ｎｒ数据库和ＥｓＴ数据库检索．构建ＥｓＴ重叠群。
．１．２．２人类基网组草图搜索法扶得该基因全长ｃＤＮＡ：将该ＥｓＴ重叠群定位在人类基因组框架草图ｈ找到对应的大规模测序片段，在该ＥｓＴ重叠群５’端ｆ：游对应的大规模测序片段中，寻找与阅读框架起始密码＿Ｆ处ｒ同一阅读框架的终止密码子，在终止密码子附近及其上游设计２条引物ｐＦＲｗ—ｆ（外弓Ｉ物，５’ＧＡＴＩＴ丁ＴｃＧＴＡ７ｆ’１１ＢＧＴＡＧＴ一１’ｌ℃３’）和ｐＦＲｗ２（内弓Ｉ物，５７ｃＴｃｃＡＴｒｃ—ｃＡｌｖｒＡＴＡｃｃ，几Ｔ（：Ａｃ３ｍ在阅读框架起始密码子下游设计２条引物ｐＲＶｓ之（内引物，５’ＧＡＧＡｃＡ—ｃｒ１１ＧＧＧＡＡＡｃＣＡＡｃＡＧ３’）和ｐＲＶｓ一１（外弓『物，５’ＧＧＡＡ‘ｒｒｃＧＴＧＧＡＡｃＴ（：ＧＧｃＧＡ３７）．然后用上述引物，以ＪＥ常鼻咽组织ｃＤＮＡ为模板，进行ＰｃＲ扩增．１．２．３ＲＮＡ印迹确定基因的转录水大小：以正常鼻咽ｃＤＮＡ为模板，以基因特异性引物进行ＰｃＲ扩增．ＰｃＲ纯化试剂盒回收ＰｃＲ产物，以“。
”Ｐ．ｄｃＴＰ为标记物，用随机引物标记试剂盒标记该片段，探针的比放射活性是每微克ＤＮＡ的放射性活性大于ｌ×１０“．ｓ。
ｐｈａｄｅｘｃ一５０柱纯化探针．采用ＭｕｌｔｉｐｌｅＴｉｓｓｕｅＮｏｒｔｈｅｒｎ（ＭＴＮｒⅥ）ＢｌｏＬｓ，Ｅ１ｐ舱ｓｓＨｙｂ…杂交液，６８℃预杂交３０ｍｉｎ，６８屯杂交２ｈ．２×ｓｓｃ、Ｏ．】％ｓＩ）ｓ，３７℃，１５ｍｉｎ洗膜３次；Ｏ，１×ｓｓｃ、０１％ｓＤｓ，５０℃，２０ｎｌｉｎ洗膜２次．一７０℃放射自显影２—４天，ｘ光片显影，定影．１．２．４ＮＡＰｌ基因的染色体定位和基因组结构分析：将ＮＡＰｌ基因ｃＤＮＡ序列与人类基因组草图进行相似性比较，进行基因的染色体定位和确定ｃＤＮＡ序列的内含子和外显子结构．１．２．ｓ差异ＲＴ—ＰｃＲ检测ＮＡＰｌ基因在鼻瞩活检组织及其对侧相应部位的正常鼻咽组织中的表达差异：Ｉ）ＮａｓｅＩ处理总ＲＮＡ，３７０ｃ，反应ｌｈ用ＤＥＰｃ水将上述反应物稀释至２００“ｌ，用等龟Ｔｉｚｏｌ抽提去除蛋白质，最新用ＤＥＰｃ水溶解ＲＮＡ，以ＧＡＰＤＨ引物进行ＰｃＲ扩增检测有无ｇＤＮＡ残留．采用两步法Ｒ’ｒ—Ｉ’ｃＲ．ＰＣＲ产物于１．０％琼脂糖凝胶电泳．１．２．６灰度扫描与数据处理：以ＧＡＰＤＨ为内对照，ＲＴ—ＰｃＲ产物条带用图像分析仪（Ｐｈａｍａｃｉａ公司产品）进行灰度扫描，ＩｍａｇｅｍａｓｔｅｒＶＤｓ图像分析软件测定产物条带的扫描积分吸光度值（肘）．Ⅳ（¨）为』下常鼻咽组织中日的片段Ｍ／（ｊＡＰＤＨ的Ｍ，ｒ（Ｍ）为鼻咽癌组织巾目的片段似／ｃＡＰＩ）Ｈ的似；Ⅳ（Ｈ）／ｒ（肼）大于２，表明ＮＡＰｌ基囚在鼻咽活检组织中表达下凋；，ｖ（ｍ）／７’（，Ａ）小于０５表明ＮＡＰｌ基因在鼻叫活检组织中表达上调．１．２．７原位杂交：采用ＰｃＲＤＩＧＰｍｂｅｓｖｌｌⅡ１ｅｓｉｓ方法标汜基因特异性ｃＤＮＡ探针．经顶杂交，杂交，杂交后处理，然后进行免疫检测，核固红复染、二甲苯透明、中性树胶封片，照相．１．２．８免疫组化：各种组织同定、包埋、切片后，脱蜡、抗原修复．免疫组化检测采用ＡｎｔｊｂｏｄｙＤｉ８９ｎｏｓｔｉｃａｌｎｃ，的“二步法”系统二甲苯透明，中性树胶封片．显微镜下观察，２结果２．１ＧｅｎＢ∞ｋ数据库检索和ＥｓＴ序列拼接以ＢＧ２３１１９７序列为种子序列，采用Ｂｌａｓｔ软件进行ＧｅｎＢａｎｋ的ｎｒ数据库和ＥｓＴ数据库检索．我”Ｊ得至０ｃＢｌ４００８２、Ａ１３３２５６０、Ｂｃ０５９０９３和Ａ１７０１５８９共４个具有高度相似件的Ｆｓｌｌ，并将其组装为５０２ｂｐ的ＥｓＴ重叠群，经与人类基因组草图进行序列校正，获得了全长为５０２ｂｐ的ｃＤＮＡ序列２．２全长ｃＤＮＡ序列的获得和阅读框架的确定利用ＮｃＢＩ的０ＲＦ６ｎｄｅｒ服务器，分析发现该序列具有完整的阅读框架．但在ｃＤＮＡ序列的５７端未见与阅读框架起始密码子处于同一蒯滇框架的终止密码子．根据ＥｓＴ序列拼接的ＥｓＴ再霍群，采用人类基因组草图搜索法获得的理论扩增产物应为（ｊ）１７６ｂｐ（ｐＦＲｗ＿２和ｐＲｖＳ＿２）、（２）２８２ｂｐ（ｐＦＲｗ＿２和ｐＲＶｓ—１）、（了）２９６ｂｐ（ｐＦＲｗ，１和ｐＲＶｓ，２）和（４）４０２ｂｐ（ｐＦＲｗ一１和ｐＲＶｓ一１）．实验结果显示，未扩增出（３）和（４）的目的条带，（Ｊ）和（２）的扩增条带大小与理论扩增产物大小基本一致（图１）．从而获得了基因的全长ｃＤＮＡ序列．在ｃＤＮＡ阅读框架的起始密码子和终止密码子段的两侧设计引物，进行ＰｃＲ扩增，将生物化学与生物物理进展Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２００４；３１（５）ＰＣＲ产物（２９４ｂｐ）克降到ｐＵＣｍ—Ｔ载体，转化ＪＭｌ０９，进行ＰＣＲ扩增鉴定（图２），测序结果与利用ＮＣＢＩ的ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ服务器分析结果一致Ｆｉｇ．１Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ５’ｅｎｄ’ｓＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔＮＡＰＩｂｙｕｓｉｎｇｄｒａｆｔｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅｓｅａｒｃｈｉｎｇｌ：ｐＦＲＷ－２ａｎｄｐＨＶＳ－２（１７６ｂｐ）；２：ｐＦＲＷ－２ａｎｄｐＲＶＳ一（２８２ｂｐ）；３：∥ＲＷ一１ａｎｄｐＲＶＳ－２（ｎＯ）：４：ｐＦＲｒｘⅧＩｐＲＶＳ－１（ｎｏ）Ｍ：ＰＣＲｎｌａｌ＇ｋｅｒＦｉｇ．２ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｄｏｎｅｂｙＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｕｓｉｎｇｐＦＲＷ－３ａｎｄｐＲＶＳ－３（２９４ｂｐ），一９：Ｃ１０ｎｅｎｕｎｌｂｅｒＭ：ＰｃＲｍａｒｋｅｒ２．３确定转录本大小用ｄ３２Ｐ－ｄＣＴＰ标记ＮＡＰｌ基因片段，与含１５种正常成人组织的多组织ＲＮＡ印迹膜杂交．结果表明该基因在淋巴结和气管中高表达，转录本大小约为０．６ｋｂ，与人类基因组草图搜索法获得的基因仝长ｅＤＮＡ大小一致．在大脑、心脏、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾、胰腺、胃、甲状腺、脊髓、肾Ｉ．腺和骨髓中未检测到表达（图３）．ｎ导３ＮｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆＮＡＰｌｉｎ１５ｋｉｎｄｓｏｆｔｉｓｓｕｅｓｏｆｈｕｍａｎ，：ｈｅａｄ；２：ｂｒｍｎ；３：ｐｌａｃｅｎｔａ；４：ｌｕｎｇ；５：ｌｉｖｅｒ；６：ｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅ：７：ｋｉｄｎｅｙ；８：ｐ衄ｃｌｅａｓ；９：ｓｔｏｍａｃｈ；Ｊ０：ｔｈｙｒｏｉｄ；Ｊ，：ｓｐｉｎａｌｃｏｒｄ：１２：ｌｙｍｐｈｎｏｄｅ；１３：ｔｒａｃｈｅａ；１４：ａｄｒｅｎ缸ｇｌａｎｄ；１５：ｂｏ…ｍ…２．４ＤＮＡ序列和基因组结构分析ＮＡＰＩ基因（ＧｅｎＢｍａｋ登录号为ＡＹｌ９０３２６）ｃＤＮＡ序列全长为５７３ｂｐ，可渎框架位于第１１３—３７０位之间，编码由８５个氨基酸组成，相对分子质量为９７００的蛋白质（图４）．ＮＡＰｌ基因定位在染色体４ｑ１３，基因组跨越９１７９ｂｐ，含５个外显子和４个内含子．内含子和外显子交界区符合ａｇ．射规则（表１）ｃｔｅｃａｔｔｃｃａＬｂａＬａｃｅ¨ｔｇａｇＬａｔａｔａａａａｃａｇｃＬ㈣ａｔａｔｔｃｃａｇｇｇｃｃａｇ［ｃａｃＬ｛ｇｃｃａｔｔｔｃｔｃａｔａａｃａｇｃｇＬｃａｇａｇａｇａａａｇａａｃｔｇａｃｔｇａａａｃｇＬＬＬｇａｇａｔｇａａｇａａａＭＫＫｇｔｔｃｔｃｅｔｃｃｔｇａｔｃａｃａｇｃｃａＬｃｔｔｇｇｃａｇｔｇｇｅｔｇｔｌｇｇｔＬＬｃｃｃａｇｔｃｔｃｔｅａａｇａｅＶＬＬＬＩ７ＩＡＴＡＶ＾ｖ０ＦＰＶＳ０ＤｃａＲｇａａｃｇｇｇａａａａａａｇａａｇｔａＬｃａｇＬｇ㈣ｇｃｇａｔｇａａｔｔａｇｃｔｔｃａｇｇｇＬｔｔｔｔｔｇｔｇｑＥＲＥＫＲＳｌＳＤＳＤＥＬＡＳＧＦＦＶｔｔｃｃｃＬｔａｃｃｃａｔａｔｃｃａｔｔｔｅｇｅｃｃａｃｔＬＣＣＯＣＧＨ｛ＩｔｔｃｃａｔｔｔｅｅａａｇａｔｔＬｃｃａＬｇｇＦＰＹＰＹＰＦＲＰＬＰＰＴＰＦＰＲＦＰＷｎｔａｇａｃｇｔａａＣｔ￡ｔｃｃｔａｔｔｃｃａａｔａｃｃｔｇａａｔｃｔｇｃｃｃｃｔａｃａａｃｔｃｃｃｃｔｔｃｅｔａｇｃＦＲＲＮＦＰＴＰＴＰＥＳＡＰＴＴＰＬＰＳ＊ａａａａＥｔａａａｃａａｇａａｇｇａａａａｇＬｃａｃＳａｔａａａｃｃｔｇｇｔｃａｃｃｔｇａａａＬＬｇａａａｔｔｇａｇｃＦ１１｝ｃａｃＬｔｅｅＬＬｇａａｇａａｔｃａａａａｔｔｃｃｔｇｔ‘！§地ａｇａａａａａｃａａａｔｇｔａａｔｔｇａａａｔａｇｃａｃａｃａｇｃａｔｔｃｔｃｔａｇｔｃａａｔａＬｃｔＬｔａｇｔｇａｔｃｔｔｃｔｔｔ！型旦塑ｃＬｔｇａａａｇｃａａａｇａｔｔｔｔｇｇｔｔＬｃＬＬａａＬＬｔｃｃａｃ（ａ）１０¨昏４ｅＤＮＡａｎｄｐｒｅｄｉｃｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＮＡＰＩＳｔｏｐｃｅｄｏｎｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｂｙａｓｔｅｒｉｓｋ（十）Ｔａｂｌｅ１Ｅｘｏｎ－ｉｎｔｒｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎｏｆＮＡＰｌｇｅｎｅＵｐｐｅｒｃａｓｅａｎｄｌ【ｌ……Ｆｅｔｔｅｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｃｘｏｎａｎｄｉｎｈ＿０ｎ”ｑｕｅｎｃｅｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙＣｏｎｓｅ］Ｔｅｄｓｐｌｉｃｅｄｏｎｏｒａｎｄａｃｃｒｐｔｍ＂ｄｉｎｕｃｌｅｏｌｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓａ忡ｉｎｄｉｃａｔｅｄｉｎｂｏｌｄ生物化学与生物物理进展Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．４６７２．５ＮＡＰｌ基因的染色体定位将ＮＡＰｌ基因序列与人类基因组草图进行相似性比较（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ！ｇｅｎｏｍｅ／ｇｕｉｄｅ／ｈｕｍａｎ／），发现该基因与人类４号染色体上的ＮＴ一０３０６４０．５序列高度相似，该序列定位于４ｑ｜３．２．６ＤＮＡ序列及蛋白质序列同源性分析ＥｘＰＡＳｙ服务器和ＮＣＢＩ的Ｂｌａｓｔ软件的分析结果表明，ＮＡＰｌ蛋白质与滤泡树突状细胞（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ，ＦＩ）Ｃ）的一种分泌肽前体（ＦＤＣ—ＳＰ）（ＡＦ４３５０８０）同源（相似性为７７％）．与其他已知蛋白质无明显同源性．蛋白质的理论ｐ，为９．３０，为一种碱性蛋白质．蛋白质有１个亲水区和１个疏水区生物信息学ＮｅｕｒａｌＮｅｔｗｏｒｋｓ分析表明，该蛋白质为分泌型蛋白质，具有３个磷酸化和１个脯氨酸富聚区等功能位点．２．７ＮＡＰｌ基因的差异性表达采用ＮＡＰｌ基因序列特异性引物（ｐＦｌＲＷ－３和ｐＲＶＳ－３），４０例正常鼻咽组织及鼻咽癌组织ＲＴ．ＰＣＲ结果显示，在４０例鼻咽癌中，该基因表达下调的有１７例（４２．５％），表达上调的有６例（１５％），无明显表达差异的有１７例（４２．５％）（表２）．Ｔａｂｋ２ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎＮＰＣａｎｄＮＰｔｉｓｓｕｅｓｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌＲＴ－ＰＣＲｉｎ４０ｃａｓｅｓ州：Ｉｎｔｅｇｒａ／ａｂｓｏｌｌＪｔｉⅢ】ｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ；Ⅳ（／Ａ）＝“（Ⅳ）／儿（ＧＡＰＤＩＩ）；？’（／Ａ）＝／Ａ（ｒ）／／Ａ（ＧＡＰＤＨ）；Ｎ（ｔＡ）／ｒ（１．４）＞２：ｌｏｗｅ。