染色体免疫共沉淀（Chip）实验报告
步骤一：样品准备
试剂和仪器：
Biopulverizer(biospec)
37% formaldehyde
甘氨酸(Glycine)
PBS
protease inhibitors
步骤二：细胞交联
1. 向客户提供的细胞沉淀中加入1ml 细胞培养基，混匀细胞后转移到15ml离心管中。

2. 向15ml离心管中加入270ul 37%甲醛溶液，使得甲醛的终浓度为1%，室温温育10min。

3. 向反应体系中各加入505ul 2.5M甘氨酸到终浓度为125mM，室温温育5min以终止交联反应。

4. 135x g，4°C离心10min，去上清，并用冰冷的10ml 1XPBS迅速漂洗两次。

5. 吸净PBS后，加入1ml PBS+protease inhibitors混合液，并转移到1.5ml离心管中。

800Xg，4°C离心
5min，小心去掉上清。

步骤三：细胞裂解
试剂:
裂解缓冲液1: 50mM Hepes-KOH pH7.5; NaCl 140mM; EDTA 1mM; glycerol 10%;NP-40 0.5%;
Tritonx -100 0.25%。

裂解缓冲液2: 10mM Tris-HCl pH8.0; NaCl 100mM; EDTA 1mM pH8.0; Na-Deoxycholate 0.1% Protease inhibitors。

步骤:
1. 加入蛋白酶抑制剂(终浓度为1x) 到所有的裂解缓冲液中。

2. 用1ml的裂解缓冲液1重悬上述处理的样品，4°C旋转混合10min后，800g，4°C离心5min，弃上清。

3. 用300ul 裂解缓冲液2重悬样品，冰上放置30min。

步骤四：超声破碎ＤＮＡ
仪器:
Bioruptor(Diagenode)
步骤:
(1)、将超声仪器Bioruptor 调到中档“Mid”(M)。

(2)、在超声池中注入一定量的冰水。

(3)、将上述1.5ml Ep管置于超声固定架中。

(4)、将带有Ep管的固定架放入已注入冰水的超声池中，超声10分钟。

(30 seconds “ON” & 30 seconds
“OFF”。

)
(5)、超声完成后，各取25ul直接接交联和纯化(具体操作见后洗脱和纯化步骤)后于2%琼脂糖凝胶电泳。

超声后电泳图附件1。

步骤五：ＣＨＩＰ
试剂：
Dilution Buffer: 0.01% SDS;1.1% Triton X-100;1.2mM EDTA;16.7mM Tris-HCl，pH 8.1; 167mM NaCl
Protease Inhibitor Cocktail
Wash Buffer: low salt: 0.1%SDS; 1% Triton X-100; 2mM EDTA; 20mM Tris-HCl，pH8.1; 150mM NaCl
high salt: 0.1%SDS; 1% Triton X-100; 2mM EDTA; 20mM Tris-HCl，pH8.1; 500mM
NaCl
LiCl: 0.25M LiCl; 1%NP40; 1% deoxycholate; 1mM EDTA; 10mM Tris-HCl，pH8.1
TE: 10mM Tris-HCl，1mM EDTA pH8.0
Biomag TM magnetic beads (Bangs laboratories. Inc)
Anti-hnRNP K antibody
步骤：
1. 将上述超声的样品分成3份，1份为25ul用作Input，并保存于4°C。

1份为250ul用作实验，作上标记后
向实验管中加入555μl 含Protease Inhibitor Cocktail 的Dilution Buffer。

2. 加入50μl magnetic beads coupled anti-mouse IgG，于4°C旋转混合30min。

3. 用Magnetic Separation Rack 于4°C吸附磁珠2min。

4. 分别转移上清到两个新的Ep管中，分别为425uL，并标记为对应细胞的IP和neg。

同时去掉原磁珠。

5. 向标记为IP的实验管中加入5ug抗体，并和neg 于4°C旋转混合过夜。

6. 加50μl magnetic bead 至IP和neg反应管中，于4°C旋转混合1h。

7. 用Magnetic Separation Rack于4°C吸附磁珠2min。

8. 弃掉上清(上清中包括未结合的染色质，若需要，也可保存用作后续分析)。

9. 分别按顺序用500ul下列溶液洗涤磁珠。

每次育4°C旋转混合5min。

_ Low salt ; wash once
_ High salt ; wash once
_ LiCl ; wash once
_ TE ; wash twice
完成后，用Magnetic Separation Rack 于4°C吸附磁珠2min，去上清。

步骤六：洗脱
Kits and Materials:
One-Day Chromatin immunoprecipitation Kit(Millipore):
Proteinase K(10ug/ul)
ChIP Elution Buffer
步骤:
1. 解冻Proteinase K和ChIP Elution Buffer到室温，并按100ul ChIP Elution Buffer/1 μl Proteinase K的
比例配制成洗脱混合液。

2. 向各反应管中分别加入500ul 洗脱混合液。

3. 于62°C旋转温育2h。

4. 加入RNase到终浓度为1ug/ml并于37°C温育20min。

5. 95 °C温育10min。

6. 冷却至室温。

7. 用Magnetic Separation Rack 于4°C吸附磁珠2min，将上清转移至新的Ep管中。

步骤七：纯化
试剂和仪器：
酚/氯仿/异戊醇＝25:24:1
5M NaCl
Glycogen (糖原)
无水乙醇
Tris-HCl pH 8.0
Nanodrop ND-1000
Procedure:
1. 分别向各反应管中加入500ul酚/氯仿/异戊醇混合液，用手剧烈振荡15秒。

2. 13000Xg 室温离心5min，小心将上层水相转移至新的Ep管中。

3. 分别加入5M NaCl到终浓度200mM，和30ug Glycogen and 1ml无水乙醇
4. -80°C放置至少30min。

5. 13000Xg，4°C，离心20min以沉淀DNA。

6. 用500ul 70%乙醇溶液洗涤沉淀。

7. 室温风干沉淀后，加入20ul 10mM Tris-HCl pH 8.0溶解沉淀。

8. 用Nanodrop测定DNA浓度，结果请见附件2。