前景
1. 目前 CRISPR-Cas9 系统中仍有一系列有待解决与发展的问题，例如如何 突破 PAM 序列的限制、如何建立对 Cas9 特异性(脱靶效应)的全面评价体系、 如何构建不同物种中可通用的 Cas9 与 sgRNA 导入与表达系统以及如何更有 效的激活同源重组修复等。但是基于CRISPR-Cas9 系统的迅猛发展速度，我 们可以预见，随着相关基础科学研究的深入，CＲISPＲ-Cas9系统将在基因组 水平上的基因改造、转录调控与表观遗传调控等不同层次上得到更广阔的发 展与应用。
疾病治疗方向应用
以CRISPR/Cas9为基础的基因编辑技术在一系列基因治疗的应用领 域都展现出极大的应用前景，如血液病、肿瘤和其他遗传疾病。 CRISPR/Cas9在多种类型的细胞和组织中都具有高效精确的基因编 辑能力，在CAR-T、造血干细胞等体外治疗手段中是一个非常理想 的操作平台，在体内也可适用。
yes
yes
yes
DNA序列
（基因组
水平） 复杂
yes yes
yes
yes
yes
优点
操作简单，靶向精确性更高，成本低 可对靶基因单个位点或多个位点同时敲除 可同时对多个靶基因进行敲除
是由RNA调控的对DNA的修饰，其基因修饰可遗传
可应用于任何物种 拥有CRISPR/Cas9腺病毒/慢病毒系统，对分裂期和 非分裂期细胞均有感染作用。
进展
4 在拟南芥研究方面，利用C ＲISPＲ/Cas 系统对分裂组织有 针对性地定点诱变产生遗传突变， 结果表明，在拟南芥中使用 CＲ ISPＲ/Cas系统为 RNA 引导的核 酸内切酶(RGEN)定点突变分裂组 织提供了一种有效的遗传基因工 程的方法。
进展
5 CRISPR/Cas 的 打 靶 效 率 比 较 高，最 高 可 达 80% ，且靶位点设计灵活、方便，载 体构建简单;CRISPR/Cas 技术已经做到了降低脱 靶的几率，降低细胞毒性，但这并不是代表不会 产生; 此外较于 ZFN与 TALEN，CRISPR/Cas 的 设计更为简单、廉价，一般普通的试验也可自行 操作; 现在的技术已经做到，可使CRISPR/Cas 同时打靶多个基因，且每多一个靶位点只需多一 个 gRNA 质粒。
模式
动物 关的基因来用小鼠或其他模型动物建立
相应的疾病模型。研究者可以应用这些
疾病模型研究疾病的发病机制,再现疾病
发生过程;也可用于筛选有效治疗药物,
或通过研究特异的表面分子、信号通路
等开发新的靶向治疗药物等。
传统方式
用特定的手段将目的DNA片段插入到小鼠胚胎干细 胞中,筛选出成功修饰的胚胎干细胞,应用显微操 作技术将其移入到早期胚胎(即囊庇)中,将改造后 的脏胎移植到假孕母鼠中,再自生出的小鼠筛选疾 病模型。
应用
基因打靶技术在基因功能研究中的应用、研制人类疾病动物 模型、改良动物品系和研制动物反应器等。
简介;TALENs是一种可靶向修饰特异DNA序 列的酶，它借助于TAL效应子一种由植物细
01
菌分泌的天然蛋白来识别特异性DNA碱基对。
优点：设计更简单，特异性更高。
02
缺点：具有一定细胞毒性，模块组装过程繁
CRISPR/Cas技术灵魂人物——Feng Zhang（张锋）
MIT麦戈文脑研究所（McGovernInstitute for Brain Research）助理教授 Feng Zhang获得瓦利基金青年研究家奖（Vallee Foundation Young Investigator Award）。Feng Zhang目前的研究方向是设计新的分子工具 来操控活体大脑，他同时也是布罗德研究所（Broad Institute）的核心成 员。
“现在，人们可以用这一技术在活细胞中有效启动任何基因。这个系统可 以让科学家们更简便地研究不同基因的功能。”
改造后的CRISPR技术，可以快速对整个基因组进行功能筛选，帮助人们 鉴定涉及特定疾病的基因。张锋等人在这项研究中就鉴定了让黑色素瘤细 胞抵抗癌症药物的几个基因。
基因敲除的四种方法
1
锌指核酸酶(ZFN)
associated (Cas) systems
（常间回文重复序列丛集关联蛋白系统）
CRISPR表示成簇的规律间隔的短回文重复序列， 02 而Cas是一种和CRISPR系统相关联的蛋白质、
基因家族，其可以以序列依赖性的方式对DNA进 行切割和靶向作用。
What
细菌和古细菌一种不断进化适应 的免疫防御机制
琐，一般需要求助于外包公司
03
应用：基于TALE的基因组编辑技术已经被广泛作用于基 因敲除、敲入、转录激活等。
类转录活化 因子核酸酶
(TALEN)
04
其他技术的不足
利用CRISPR/Cas技术构建基因敲出小鼠的效率非常高，可以 非常高效率地在四个位点上对两个基因进行敲出，效率达到了 80%左右。如果利用TALENT技术，单基因敲出的效率只有 30%。传统的基因敲除方法需要通过打靶载体构建、ES细胞筛 选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、技术要求 很高，而且费用大、耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。
方法
靶标
质粒 基因 构建 下调
基因敲 除
基因定点突 变或多点突 变
基因组改变
遗传密码 子改变
遗传性
RNAi(siRNA,shRNA)
mRNA（转 录水平）
简单
yes
siRNA：瞬转 ；
NO
NO
NO
shRNA:可借助 慢病毒实现遗
传性
CRISPR TALEN
DNA序列
（基因组
水平） 简单
yes yes
利用CRISPRCas进行基因组工程，图中不同颜色的剪刀 代表着不同的Cas9酶
应用
用CRISPR/Cas技术绕过了胚胎干细胞操作过程,可快速而有效地建立 携带多个基因突变的小鼠。因其不依赖在胚胎干细胞上操作,可用于多生物 细胞的基因操作。模型生物的建立也不再局限于小鼠及少数大鼠中,任何可 进行胚胎操作的物种都能成为基因组工程的目标。
力因子测试和MLST 基因型明显相关。
进展
2 在斑马鱼研究方面，通过注射两个 简单的体外合成的组件(即使用一个密 码子优化的Cas9 和单链向导 sgＲNA) 到单细胞期胚胎中，使目标基因突变。 这种灵活的基因失活的方法为斑马鱼 基因功能和基因相互作用提供了一个 有效的方式。
进展
3 干细胞中的定点突变，包括引进或疾病患者特异性突变模 型的修正。然而，在人类胚胎干细胞中将一个报告基因整合成 一种内源性基因还需要漫长艰苦的两步:首先要正确识别目标然 后要排除耐药性。研究发现，tracrＲNA 和crＲNA 分开单独表 达，还能够提高切割的效率。这个发现让大家意识到:可以通过 进一步修改 sgＲNA 的设计方案，让它与双 ＲNA 复合体的结 构更加相近，就能够进一步提高 Cas9 系统的基因组编辑效率。
更容易得到纯合子突变体
缺点
传统的转基因和基因打靶技术，由于技术稳定成 熟，可以对小鼠和大鼠的基因组序列进行各种修 饰，仍将是模式动物的构建的主要技术。该系统 是否有脱靶效应尚需进一步的研究
缺点
CRISPR-Cas技术尤其是CRISPR-Cas9作为基因 编辑的核心技术，它仍然是一项非常新颖的技术， 除了存在“脱靶”的主要问题外，还有许多的技 术难点尚未突破，尤其是临床应用的有效性和安 全性依然是科学家关注和争论的焦点。
04
不是会引起免疫系统的进攻。 2、直接体内注入基因的效率低。 3、在细胞内精确度难以预估。
ES 细胞 打靶
定义
基因打靶是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定
基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。
原理
获得ES细胞系，用同源重组技术获得带有预先设计突变的中靶 ES细胞。通过显微注射或者胚胎融合将经过遗传修饰的ES细胞 引入受体胚胎内。ES细胞仍然保持分化的全能性，可发育为嵌 合体动物的生殖细胞，使修饰过的遗传信息经生殖系遗传。获 得的突变动物提供了一个特殊的研究体系，使他们可以在生物 活体中研究特定基因的功能。
进展
细菌，哺 乳动物
干细胞的 定点突变
多基因 打靶
01
02
03
04
ห้องสมุดไป่ตู้
05
06
斑马鱼
拟南芥
靶序列 互补
进展
1 随着 CＲISPＲ/Cas 技术的快速发展,它已经被广泛应用于细菌、人 类胚胎干细胞、哺乳动物细胞、酿酒酵母、线虫、果蝇和农作物等的 基因研究，并具有操作简单、快速、靶向精确性高、可实现对靶基因 多个位点同时敲除等特点。在细菌研究方面，确定了副溶血性弧菌的 6 个不同的 CＲISPＲ序列类型，同时 CＲISPＲ 序列类型被认为与毒
Spaced Repeats，SRSR）。2002年SRSR被重命名为CRISPR。
发现
2013年2月发表在《Science》杂志上的两篇文章发现CRISPR/Cas9系统 能在293T,K562等多种细胞中进行有效的靶向酶切,非同源末端连接同 源重组效率约在在3-25%之间,与被《Science》杂志评为2012年十大科 学突破之一的TALEN技术的酶切效果相当。可用于编辑人类基因组。
应用
Rudolf Jaenisch教授实验室采用CRISPR/Cas技术绕过了胚胎干细胞 操作过程，可快速而有效地建立携带多个基因突变的小鼠。这是 CRISPR/Cas技术首次被用于多细胞生物的基因操作。
应用
疾病模式 动物
基因编辑 功能应用
疾病治疗 方向应用
。
疾病模式动物
疾病
科学家们一直改变与特定疾病相
前景
2. 自 Cas9 被发现以来，研究人员一直把它作为一把有潜力的钥匙来开 启遗传疾病的新疗法，并且利用ＲNA 导向的 Cas9 核酸酶在哺乳动物细胞 和斑马鱼胚胎中进行基因组编辑。研究发现，Cas9/gＲNA 有效诱导了生成 的体细胞中 etsrp 或 gata5 的双等位基因转换。研究者通过 Cas9/gＲNA 系统的诱导在斑马鱼胚胎中获得了位点特异性的 mloxP 序列插入。因此， Cas9 核酸酶的功能远远大于目前所了解到的，加大对 Cas9 核酸酶的特异 性研究并深入了解，有助于生命科学的研究。