型变态反应及 Th1 细胞因子相关的研究则较少。 迟发型 变态反 应可分 为致 敏阶段 和效 应阶
段, 在致敏阶段受抗原刺激 T 淋巴细胞发生增殖 分化, 在效应阶段相同 抗原的再次刺 激使致敏 T 细胞释放出多种细胞因子, 并引致大量淋巴细胞、 巨噬细胞 等的聚集, 引起炎症反 应。鉴于迟发型 变态反应在许多免疫性疾病发生发展中的重要作
绵羊红细胞( SRBC) 由江宁卫生防疫站提供。其余 试剂均为市售分析纯产品。
1 材料与方法
12 方 法
11 材 料 1 1 1 实验动物 雌性 ICR 小鼠, 体重 18~ 22 g, 由中国药科大学实验动物中心提供。 1 1 2 药品与试剂 罗红霉素由扬子江制药有限
收稿日期 2004 03 29 * 通 讯 作 者 徐 强: 教 授, 博 导, 长 江 学 者, Tel ( Fax) : 025 83592620, E mail: molpharm@ 163. com
1 2 1 SRBC 诱 导小 鼠迟 发型 变态 反应 ( SRBC DTH) 参照 Machon Z 等人的方法[ 9, 10] 。小鼠随机
分为正常对照组( normal) 、模型对照组( control) 、阳 性药醋酸泼尼松组( Pred) 及罗红霉素组。实验当 天正常对照组于右后足垫 sc PBS 50 l 只, 其余各 小鼠 sc 2 5 108 mL SRBC 50 l 只进行致敏, 5 d 后于正常对照组小鼠左后足垫 sc PBS 50 l 只, 其
细胞以 1 106 孔接种于 96 孔板, 37 , 5% CO2条件下培养 2 h, 吸弃未贴壁细胞, PBS 洗 2 次。
加入 RPMI 1640 培养基、药物及终浓度为 1 g mL 的 LPS, 共育 24、36 h 后吸取各孔上清 100 l, 加入 等体积 Griess 试剂, 混匀, 室温下放置 10 min, 以重 蒸水调零, 酶标仪上测各孔 OD540 。同时制作标准 曲线以求出样本内 NO2 - 的浓度。
50 0
Footpad swel ling was measured 12 h after the f inal administration # # P <
0 01 vs normal ; * P < 0 05, * * P< 0 01 vs control
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2 次, 细胞混悬于含 0 02% NaN3的 500 l PBS 中,
离心后将细胞混匀, 加入 100 g mL PI 100 l, 含 2% Triton X 100 及 100 g mL 的 PBS 100 l。室温 避光放置 20~ 30 min, 用流式细胞仪检测。 1 2 5 大鼠腹腔巨噬细胞( M ) 制备、NO 产生及 测定[ 12] 大鼠 ip 3% 无菌 thioglycollate broth 3 mL 只, 3 d 后脱颈椎处死大鼠, 全身浸泡于 75% 乙醇 中 5 min, ip D Hank s 溶液 20 mL, 轻轻按摩腹部 5 min, 剪 开 腹部 皮肤、肌 肉, 吸取 腹 腔液, 并 用 D Hank s 溶液洗腹腔 2 次, 10 mL 次, 合并腹腔液, 经 4 、500 g 离心 5 min, D Hank s 溶液洗细胞沉淀 1 次, 加入含 10% NCS 的 RPMI 1640 培养液, 台盼蓝 排斥法进行细胞计数, 调细胞浓度为 1 107 mL 备 用。
罗红霉素 10、20 mg kg 于攻击后给药显著减
轻小鼠足垫肿胀度, 20 mg kg 剂量抑制作用与 10
mg kg 泼尼松相当。见表 1。
Table 1 Effect of roxithromycin on SRBC induced footpad swelling in mice ( x s, n= 10)
l, 振摇 2 min, 放置 10 min, 用酶标仪测定 540 nm 波长处的吸收度( OD540 ) , 计算刺激指数( SI) 。
SI= OD 加 Con A 孔 OD 无 Con A 孔 1 2 3 小鼠脾细胞体外存活及增殖能力的检测 取正常小鼠, 以 10、20 mg kg 罗红霉素或 10 mg kg 泼尼松连续灌胃 9 d, 末次灌胃后 1 h 按照 1 2 2 方法制备小鼠脾细胞, 以 1 106 孔分别接种于 96 孔板, 培养 3 d 后用 MTT 法测定活细胞的数量( 以 OD540 表示) , 将该细胞数与培养前的细胞数的比值
罗红霉素对迟发型变态反应的抑制作用
刘 康1 , 徐 强2*
1 中国药科大学中药药理教研室, 南京 210038; 2 南京大学医药生物技术国家重点实验室, 南京 210093
摘 要 目的: 探讨罗红霉素对迟发型变态反 应及其相 关细胞 的影响。方 法: 整体实 验: 以 绵羊红 细胞
( SRBC) 诱导小鼠迟发型变态反应( DTH) 。离体实验: 分离培养小鼠脾细胞和大鼠腹腔巨噬细胞, 采用 MTT 比色
用, 本研究首先观察了 罗红霉素对迟发型变态反 应的影响, 进一步从淋巴细胞的增殖、凋亡及巨噬 细胞的功能等角度探讨了其作用机制。
公司提供, 体外 实验 中将 其溶 于二 甲亚 砜 ( DM SO) , 用前以相应培养液稀释, 使 DMSO 终浓度低 于 0 1% 。地塞米松磷酸钠注射剂( Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, Dex ) 购自常州第二制药 厂; 醋酸泼尼松片( Prednisone Acetate T abletes, Pred) 购自 浙 江 医 药 股 份 有 限 公 司; 刀 豆 蛋 白 ( Con canavalin, Con A) , 脂多糖( Lipopolysac charide, LPS) , 噻唑蓝( Thiazolyl Blue, MTT ) , 磺胺( Sulfanilamide) , 萘乙二胺盐[ N ( 1 naphthyl ethylenediamine) dihydro chloride] , 一氧 化氮合酶抑制 剂 N nitro L arginine ( LNNA) , Thioglycollate broth, 碘化丙吡( Iodized Pyri dine, PI) 均为 Sigma 公司产品; 新生小牛血清( New Calf Serum, NCS) 为 PAA Laboratory GmbH 产品; RP MI1640、DMEM F12 培养基为 Gibco 产品; D Hank s 溶液、磷酸盐缓冲液( PBS) 、Tris NH4 Cl 溶液自配。
中国天然药物 2005 年 11 月 第 3 卷 第 6 期
CJNM
Chin J Nat Med Nov 2005 Vol 3 No 6 387
它小 鼠于左 后足 垫 sc 同 体 积的 2 5 109 个 mL SRBC 进行攻击。攻 击后 0 及 12 h 各灌 胃给药 1 次, 共 2 次。攻击后 24 h, 脱颈椎处死小鼠, 用螺旋 测微器测量双侧足垫厚度, 以左、右足垫厚度差作 为其肿胀度。 1 2 2 Con A 所致小鼠脾淋巴细胞增殖[ 11] 小鼠 脱颈椎处死, 全身浸泡于 75% 酒精中 5 min, 无菌 取出脾脏, 置于盛有 3 mL 冰冷 D Hank s 液的培养 皿中, 分散成单个细胞悬液, 经 200 目过滤, 4 、 500 g 离心 5 min, 细胞 沉淀 用 20 mL 0 17 mol L Tris 0 75% NH4 Cl 破红细胞, D Hank s 洗 1 次, 用
Griess 试剂配制: 以 3% 磷酸为溶剂配 制 2% 磺胺溶液, 以重蒸水为溶剂配制 0 2% 萘乙二胺盐 酸盐溶液, 4 避光保存, 用前将二者等体积混合。 1 2 6 统计 所有数据均以平均值 标准差( x
s) 表示, 组间差异采用双侧 t 检验。
2结果
2 1 罗红霉素对 SRBC DTH 的影响
含 10% NCS 的 RPMI 1640 混悬细胞。0 4% 台盼 蓝排斥法计数活细胞数, 存活率 95% 以上。将细 胞浓度调至 1 107 mL, 4 放置备用。
取细胞, 以 5 105 孔接种于 96 孔板, 加Con A 使之终浓度为 5 g mL, 同时分别加入各药物培养 3 d。阳性药地塞米松的终浓度为 2 g mL, 罗红霉 素的终浓度为 0 2、1 0、10、50 g mL。培养后加 入 5 mg mL MTT , 20 l 孔, 继续 培养 4 h, 经4 、 500 g 离心 5 min, 吸弃上 清, 每 孔加入 DMSO 100
法测定细胞数; 以 Griess 法测定细胞释放的 NO 水平。结 果: 罗红霉素 10 和 20 mg kg 于效应相 经口给药显 著地
抑制了 SRBC 诱导的迟发型变态反应, 并使因 SRBC 免疫 增高的 淋巴细 胞体外 存活率恢 复至正 常水平; 罗 红霉
素在体外能浓度依 赖性地抑制 Con A 所致的脾淋巴细胞增殖及腹腔巨噬细胞 释放 NO; 体内给 药显著地抑 制了
作为细胞存活率。另接种相同数目的脾细胞, 加 5 g mL Con A 培养, 用 MTT 法测定活细胞数, 检测 细胞对 Con A 刺激的增殖反应, 并按上式分别计 算各鼠脾淋巴细胞的刺激指数。
依照 1 2 1 方法以 SRBC 诱导小鼠迟发型变 态反应, SRBC 攻击后 0 h 及 11 h 以 10、20 mg kg 罗红霉素或 10 mg kg 醋酸泼尼松灌胃两次。攻击 后 12 h 按照 1 2 2 方法制备小鼠脾细胞, 细胞以 1 106 孔分别接种于 96 孔板, 用 MTT 法测定 3 d 后的脾细胞数。 1 2 4 脾细胞凋亡的检测 取经过处理的小鼠脾 细胞 1 106 管, PBS 洗 1 次, 4 、500 g 离心 5 min, 细胞沉淀以 70% 冷乙醇固定 2 h 以上, PBS 洗