2011年10月第31卷第10期基础医学与临床Basic ＆Clinical Medicine October 2011Vol．31No．10收稿日期：2010－11－02修回日期：2011－03－16基金项目：扬州环境资源职业技术学院基金（07001）*通信作者（corresponding author ）：yejilin126yejilin@126．com文章编号：1001-6325（2011）10-1120-04研究论文TRAIL 诱导Hela 细胞凋亡的线粒体信号通路叶记林1*，刘永春2，于有江1，刘延庆3（1.扬州环境资源职业技术学院医学系，江苏扬州225127；2.江苏省苏北人民医院，江苏扬州225000；3.扬州大学医学院，江苏扬州225001）摘要：目的探讨TRAIL 诱导人宫颈癌Hela 细胞凋亡的线粒体通路。
方法琼脂糖凝胶电泳判断细胞凋亡；激光共聚焦、Western blot 、荧光免疫和caspase-3活性检测测定细胞线粒体膜电位（MMP ）、BCL-2蛋白、细胞色素c （Cyt c ）和凋亡诱导因子（AIF ）蛋白在细胞中的定位以及caspase-3活性。
结果TRAIL 能诱导Hela 细胞凋亡，有凋亡细胞特有的DNA 梯状条带。
同时，TRAIL 具有时间依赖性致MMP （P ＜0.05，P ＜0.01）减小和BCL-2蛋白含量明显下降，线粒体Cyt c 蛋白释放，AIF 蛋白向细胞质、细胞核转移，caspase-3活性增强（作用10h 后达到2.25ʃ0.20倍，P ＜0.05）。
结论TRAIL 诱导Hela 细胞凋亡途径之一是通过线粒体信号通路进行的。
关键词：TRAIL ；Hela 细胞；细胞凋亡；线粒体中图分类号：R 737.33文献标志码：ATRAIL induced apoptosis in Hela cells by mitochondrial signal pathwayYE Ji-lin 1*，LIU Yong-chun 2，YU You-jiang 1，LIU Yan-qing 3（1.Medical Science Department ，Yangzhou Vocational College of Environment and Resources ，Yangzhou 225127；2.Subei People's Hospitalof Jiangsu Province ，Yangzhou 225000；3.Medical Academy ，Yangzhou University ，Yangzhou 225001，China ）Abstract ：ObjectiveTo explore the mitochondrial pathway in the apoptosis of Hela cells induced by TRAIL．MethodsApoptotic cells were detected by DNA electrophoresis．The mitochondria membrane potential （MMP ），the expressions of BCL-2，the location of Cyt c and AIF ，the caspase-3activity were tested by confocal laser mi-croscopy ，western blot ，immunofluorescence and caspase-3activity assay．ResultsTRAIL can induce apoptosis inHela cells．DNA ladders were showed on agarose gel electrophoresis．At the same time ，TRAIL induced the de-crease of MMP （P ＜0.05，P ＜0.01）and BCL-2，the release of Cyt c ，the translocation of mitochondrial AIF to cytoplasm and nuclei ，the increase of caspase-3activity （the activity increased to 2.25ʃ0.20fold in 10h treated cells ，P ＜0.05）in the time-dependent manner．Conclusions TRAIL induce the apoptosis of Hela cells throughinvolves mitochondrial signal pathway．Key words ：TRAIL ；hela cel1s ；apoptosis ；mitochondria肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necro-sis factor related apoptosis inducing ligand ，TRAIL ）是肿瘤坏死因子配体超家族中的一个新成员。
它能够选择性地诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无毒性作叶记林TRAIL诱导Hela细胞凋亡的线粒体信号通路用，使其具有极大临床应用前景［1－2］。
但是肝细胞损害及相当多的肿瘤细胞对TRAIL诱导凋亡的抵抗等原因阻碍了TRAIL的应用［3］。
弄清TRAIL诱导癌细胞凋亡的发生机制是突破点。
目前有关TRAIL诱导多种肿瘤细胞凋亡的研究已取得很大进展，然而国内外关于TRAIL诱导癌细胞凋亡的线粒体信号通路的研究很少，现以Hela细胞为模型探讨TRAIL诱导癌细胞凋亡的线粒体信号通路，为临床癌症治疗提供参考。
1材料与方法1.1主要试剂人宫颈癌Hela细胞（中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库）；小牛血清（杭州四季青公司）；DMEM培养液（Gibco公司）；人TRAIL蛋白（Milli-pore公司）；DNA ladder提取试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）；罗丹明123、BCL-2兔多抗和羊抗兔IgG-HRP（Sigma公司）；细胞色素C（Cyto-chrome C，Cyt c）鼠单抗（Chemicon公司）；AIF羊多抗（eBioscience公司）；Caspase-3ApoAlert Assay kits 试剂盒（Clontech公司）。
1.2细胞培养和处理人宫颈癌Hela细胞用含10%小牛血清的DMEM培养液，在37ħ，5%CO2饱和湿度下培养。
处理细胞时，实验组用40ng/mL人TRAIL蛋白处理不同时间（1 10h），对照组加入等体积0.9%氯化钠注射液，均换含2%小牛血清的培养液进行培养。
1.3琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡收集处理后的各组细胞，按DNA ladder提取试剂盒说明书提取DNA。
取所制的样品20μL上样进行1%琼脂糖凝胶电泳40min，紫外灯下观察、摄影。
1.4Rh-123结合激光共聚焦检测MMP收集处理后的各组细胞用PBS洗涤2次，然后加入罗丹明123（Rh-123），使其终浓度为5mg/L，37ħ闭光孵育20min，再用PBS洗3遍，激光共聚焦显微镜于505nm激发光、534nm发射光实时监测细胞胞内荧光强度。
统计每个样品中所有受检测细胞的荧光强度值的均值，该值即反映相对MMP的强度。
1.5Western blot检测BCL-2、Cyt c和AIF收集处理后的各组细胞，PBS洗涤2次。
一部分细胞按常规方法提取蛋白质，恒压进行SDS电泳分离，然后电转到PVDF膜上，与BCL-2兔多抗4ħ孵育过夜，再加入羊抗兔IgG-HRP室温孵育1h，将膜洗涤干净后，加TMB显色液显色、摄影。
一部分细胞分离线粒体、细胞质蛋白。
分别以Cyt c鼠单抗和凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor，AIF）羊多抗为一抗检测Cyt c和AIF蛋白含量。
1.6荧光免疫法检测AIF的转移收集处理后的各组细胞，PBS洗涤2次，以3%多聚甲醛溶液固定。
PBS洗后以0.2%Triton X-100溶液使细胞通透。
PBS洗后再置于封闭液中封闭1h。
然后加入AIF抗体孵育2h。
封闭液洗后加入FITC标记的兔抗羊二抗孵育1h。
洗涤后置于激光共聚焦显微镜下观察。
1.7caspase-3蛋白活性检测收集处理后的各组细胞，按照ApoAlert caspase-3Assay kits试剂盒说明书进行操作。
以400nm激发光、505nm发射光的Shimadzu RF510Spectroflu-orophotometer荧光分光光度计进行检测。
1.8统计学分析实验数据以均数ʃ标准差（x—ʃs）表示；组间比较用Student's test。
2结果2.1TRAIL引起Hela细胞凋亡对照组细胞无任何剪切图谱产生，而TRAIL处理组细胞发现了约180 200bp间距的凋亡细胞所特有的DNA Ladder现象（图1）。
Hela cells treated by40ng/mL TRAIL for the indicatedtimes，M.marker； C.control图1TRAIL处理Hela细胞的DNA琼脂糖凝胶电泳Fig1DNA agarose gel electrophoresis of Helacells treated by TRAIL1211基础医学与临床Basic ＆Clinical Medicine 2011.31（10）2.2TRAIL 引起Hela 细胞MMP 的变化TRAIL 作用于Hela 细胞后致线粒体吸附Rh-123的能力下降（图2），而Rh-123荧光强度值反映的是线粒体膜电位（mitochondria membrane poten-tial ，MMP ）的大小。
TRAIL 处理4h 组与对照组相比MMP 变化不大，随着处理时间的延长，MMP 逐渐降低，呈现明显的时间依赖性（P ＜0.05，P ＜0.01）。
Hela cells treated with 40ng /mL TRAIL for the indi-cated times ；*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01compared with control 图2激光共聚焦显微镜检测细胞线粒体的Rh-123荧光强度值变化Fig 2The changes of Rh-123mitochondrial fluore-scence in the cells were detected by confocallaser microscopy （x —ʃs ，n =4）2.3TRAIL 引起Hela 细胞BCL-2蛋白含量的变化TRAIL 处理Hela 细胞，BCL-2蛋白随着TRAIL作用时间的延长而减少。