4.丙型肝炎RNA
乙型肝炎病毒(HBV)PCR检测
❖乙型肝炎病毒(HBV)概述 ❖乙型肝炎病毒基因区 ❖乙型肝炎病毒临床意义概述
乙肝病毒是已知最小的部 分双链的环形DNA病毒，长 3.2kb，有高度重叠的4个基因 区，编码至少8种蛋白。即S基 因编码的大、中、小HBs；C 基因的前C、HBc、HBe；P基 因的聚合酶和X基因的HBx。
❖ HPV的致癌机理
人乳头瘤病毒检测的临床意义
❖ 低危型
1）预防和提示外生殖器湿疣等良性性病。 2）可用于临床可疑尖锐湿疣患者的确诊，及HPV感
染的早期诊断。
❖ 高危型
1）女性常规体检，评估宫颈癌发生的可能性。 2）跟进宫颈癌的疗效，评估宫颈癌复发的可能性。
人乳头瘤病毒和宫颈癌的关系
❖早在十九世纪四十年代，一位意大利医生Regoni Stern最早提出结婚与否与宫颈癌的发生可能有关。
分布
❖ 有些亚型和地区、宫颈癌的病理类型有关。 ❖ HPV45在非洲西部很常见，HPV39和59在美洲中部和南部常见，HPV52，
58 在中国常见。在宫颈鳞状上皮细胞癌中以HPV16（占51％），在腺癌 和腺鳞癌中HPV18分别占56％和39％。
人乳头瘤病毒的致癌机理
❖ HPV的基因结构
人 乳 头 瘤 病 毒 HPV 的 基 因 结 构 按 功 能 可 分 为 早 期 区 （E区）、晚期区（L区）和非编码区（LCR）三个区域
PCR过程中,TaqMan探针
5’ 和引物与靶序列退火 淬灭剂
TaqMa
n
报告 引物
3’
探针 荧光
5’ 引物在Taq酶的聚合延伸下,
其5’外切酶活性将水解探针,
3’ 从而使荧光基团脱离淬灭剂 的作用而发出荧光
淬灭剂
靶DNA
TaqMa n
探针
3’ 引物 5’
报告 荧光
双杂交探针实时荧光PCR基本原理
福州艾迪康
PCR实验室
介绍
陈衍娇
聚合酶链反应(PCR)技术
❖ PCR发展简史 ❖ PCR基本概述 ❖ PCR基本原理
PCR发展简史
❖ 1 9 8 5 年 ， 美 国 PE-Cetus 公 司 的 Mullis 等 人 发 明 了 聚合酶链反应（PCR）
❖1993 年 ， Higuchi 等 报 道 了 实 时 PCR(realtimePCR)
PCR扩增参数
❖ 温度与时间参数
（1）变性温度与时间 （2）退火温度与时间 （3）延伸温度与时间
❖ 循环次数
PCR基本扩增过程
实时定量荧光PCR技术
❖ 实时荧光PCR基本原理 ❖ Taqman实时荧光PCR基本原理 ❖ 双杂交探针实时荧光PCR基本原理
Taqman实时荧光PCR基本原理
靶DNA
PCR基本概述
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction) 简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的 ＤＮＡ片段的分子生物学技术。
PCR基本原理
❖ PCR扩增基本要素
❖ PCR扩增过程
PCR扩增基本要素
DNA模板 DNA引物 TaqDNA聚合酶 dNTP 缓冲液 Mg2+
理想的宫颈癌筛查
临床提示，从HPV的持续感染到一般的宫颈癌前病变 并最终发展为宫颈癌大约需要5-10年。因此，必须采取 适当的预防和筛查措施，才能够阻止宫颈癌的发生并有 望最终根治。
美国肿瘤临床指导：性行为开始三年左右，不晚于21岁开始。 每年筛一次。若2～3次HPV和细胞学筛查均为正常者，可延长筛查时 间至5-8年。大于70岁，在10年内已有3次以上满意的细胞学检查和 HPV检查正常者，可停止筛查。良性子宫切除患者不需要检查，否则，
❖人乳头瘤病毒的概述 ❖人乳头瘤病毒的型别与分布 ❖人乳头瘤的致癌机理 ❖人乳头瘤病毒检测的临床意义 ❖人乳头瘤病毒感染与宫颈癌的关系 ❖理想的宫颈癌筛查
人乳头瘤病毒的概述
双链DNA无包膜病毒 ❖ 环状DNA，约8Kb； ❖ 病毒颗粒直径为50～55nm； ❖ 依靠宿主细胞进行复制、转录和翻译。
游离在细胞内，持续存在，不引起任何病变，或引 起良性病变和低度病变，如尖锐湿疣或轻度不典型增生 等。而癌变则与病毒DNA整合入染色体密切相关。HPV 感染是否发病取决于被感染的细胞是否进行成熟分化。
HPV病毒电镜图
人乳头瘤的型别与分布
型别
❖ 已发现100多种不同的亚型，其中超过40种可以感染人类的生殖器官，约30 种与肿瘤有关。
❖ 依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低可分 1）低危型：宫颈上皮内低度病变，引起外生殖器湿疣等良性性病（HPV 6、11、42等） 2）高危型：宫颈上皮内高度病变，与宫颈癌的发生有关（HPV 16、 18、 31、33、35、39 、45、51、52、53、56、58、59、66及 68等）
供体荧光基团
5’
3’
3’
靶DNA
受体荧光基团
5’
3’
5’
5’
3’
3’ 靶DNA
5’
实时荧光定量PCR工作流程
❖标本的采集 ❖标本的运送 ❖标本的处理 ❖基因扩增 ❖扩增产物分析
标本的采集
❖ 标本采集时间对扩增检测结果的影响 ❖ 标本采集部位的准备 ❖ 标本采集的类型和采集量 ❖ 采样质量的评价 ❖ 采样及运输容器 ❖ 标本采集中的防污染
PCR实验室设置
❖试剂准备区(Ⅰ区 ) ❖标本处理区( Ⅱ区 ) ❖扩增分析区( Ⅲ区 ) ❖产物分析区( Ⅳ区 )
实时荧光定量PCR的应用 我们福州PCR主要检测项目
1.乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)
2 .人乳头瘤病毒HPV23型、人乳头瘤病毒 6/11、人乳头瘤病毒16/18
3.沙眼衣原体DNA、解脲支原体DNA、淋球 菌DNA
乙肝病毒结构图
乙型肝炎病毒基因区
❖ S区 ❖ C区 ❖ P区 ❖ X区
乙型肝炎病毒临床意义
❖判断肝病的病情、预后和传染性 ❖预测抗病毒治疗的效果 ❖监测和评价抗病毒药物的疗效
乙型肝炎病毒YMDD变异
YMDD:
蛋氨酸
YIDD 突变：蛋氨酸 异亮氨酸
YVDD突变：蛋氨酸 缬氨酸
人乳头瘤病毒（HPV）PCR检测
❖1977年Laverty在电镜中观察到宫颈癌活检组织中存在 人乳头状瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）颗粒。 ❖至89年左右，约翰.霍普金斯大学教授Keerti Shah证 实子宫颈癌与HPV感染有直接关系。 ❖1995年世界卫生组织国际癌症研究所（IARC）专题讨
论会认为：HPV感染是宫颈癌发生的主要病因。