３．０
２．５
２．０
１％大 豆 蛋 白 胨
１．５
３％大 豆 蛋 白 胨
１．０
５％大 豆 蛋 白 胨
７％大 豆 蛋 白 胨 ０．５
０ ０ ６ １２ １８ ２４ ３０ ３６ 培 养 时 间／ｈ
图 ４ 氮源浓度对菌种生长的影响 Ｆｉｇ．４ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｎ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｏｗｔｈ
０．５％， 大豆蛋白胨质量分数分别为 １％、３％、５％、 ７％， 接种培养， 每隔 ２ ｈ 测定生物量并绘制生长曲 线。由图 ４ 可知， 大豆蛋白胨的适宜质量分数为 ３％， 培养 １６ ｈ 时达到最大生长量， 即 ＯＤ６００ 为 ２．６７７。 １％、５％和 ７％的大豆蛋白胨分别在 １６、２０、２０ ｈ 达 到最大生长量， 且其最大生长量均小于 ３％的大豆 蛋白胨。使用 ３％的大豆蛋白胨， 可在较短的时间 内达到最大生长量， 缩短了生产周期， 提高了设备 利用率， 降低了生产成本。
关键词 纳豆菌 培养基 二次旋转正交试验 文章编号 １００９－ ７８４８（ ２００８） ０１－ ００３３－ ０５
１９０５ 年 Ｓｈｉｎ Ｓａｗａｍｕｒａ 将产生纳豆粘性物质 的一种菌作为独立的纳豆菌（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏ） 提出。 纳豆菌的生产菌种是从日本的一种传统大豆发酵 食品— ——纳豆中提取出来的， 它是好氧的革兰氏 阳性菌［１］， 属细菌科、芽孢杆菌属， 是枯草芽孢杆菌 的一个亚种［２］。１９８７ 年， 日本的须见洋行从纳豆中 提取出具有溶血栓功能的物质， 将其定名为纳豆 激酶［３］。经试验验证其有溶纤效果［４］， 并有望成为新 一代抗栓药物［５］。目前， 对纳豆菌生长培养基的研 究报道很少。本文研究了纳豆菌生长培养基的成 分， 为优化纳豆激酶产酶条件奠定了良好的基础。
各因素对菌种生长的贡献率依次为 ｘ２＞ｘ１＞ｘ４＞ ｘ３＞ｘ５， 即各因素对菌种生长的影响依次为大豆蛋 白胨＞葡萄糖＞Ｋ２ＨＰＯ４＞ＭｇＳＯ４＞ＫＨ２ＰＯ４。
验证试验， 分别在基础种子培养基和优化培 养基中接种， 在相同条件下培养 １４ ｈ， 测定 ＯＤ６００。 优化前、后 ＯＤ６００ 值分别为 １．８６６ 和 ２．５４０， ＯＤ６００ 值 提高了 ０．６７４， 优于五元二次旋转正交设计（ １／２） 的 ３６ 组试验。
ＮａＣｌ ０．５％， 葡萄糖质量分数分别为 ２％、３％、４％、 ５％， 接种培养， 每隔 ２ ｈ 测定生物量并绘制生长曲 线。由图 ３ 可知， 葡萄糖的最适质量分数为 ２％， 菌 种的生长量处于较高的水平。以葡萄糖作碳源， 其 菌种生长的延滞期较短， 说明菌种对于葡萄糖的 利用速度较快。 ２．４ 氮源浓度对菌种生长的影响
由图 ５ 可知， ＭｇＳＯ４ 适宜的质量分数为 ０．１％， 且在培养 １８ ｈ 达到最大生长量， 即 ＯＤ６００ 为 ２．２２５。 ０．２％ ＭｇＳＯ４ 是 在 培 养 ２２ ｈ 时 达 到 最 大 生 长 量 ， ０．０５％ ＭｇＳＯ４ 是在培养 ２０ ｈ 时达到最大生长量， 其它均在 １８ ｈ 达到最大生长量， 但其 ＯＤ６００ 值均 小于 ０．１％ ＭｇＳＯ４ 的。
豆粕粉
硝酸铵 ０．５
０ ０ ４ ８ １２ １６ ２０ ２４ 培 养 时 间／ｈ
图 ２ 氮源种类对菌种生长的影响 Ｆｉｇ．２ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ｏｎ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｏｗｔｈ
生物量（ ＯＤ６００） 生物量（ ＯＤ６００）
２．３ 碳源浓度对菌种生长的影响 培 养 基 中 大 豆 蛋 白 胨 质 量 分 数 固 定 为 １％，
第８卷 第１期 ２００８ 年２月
中国食品学报
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｖｏｌ． ８ Ｎｏ． １ Ｆｅｂ． ２ ０ ０ ８
纳豆菌高产培养基的成分优化
张丽萍 １， ３ 满丽莉 ２ 马中苏 １ （ １ 吉林大学生物与农业工程学院 吉林长春 １３００２２ ２ 黑龙江农业经济职业学院 黑龙江牡丹江 １５７０００ ３ 黑龙江八一农垦大学
对回归方程求一阶偏导， 当到达局部最优点时， 导 数为零， 此计算点为驻点。经计算此驻点为极小 值， 而该方程的端点 ｆ（ ２， － ２， ２， － ２， ２） 为最大值。将 编码值换算成实际值时， 按 Ｚｊ＝Ｚ０ｊ＋ｘｊΔｊ 进行计算以 确定优化培养基成分， 即： 葡萄糖 ３％、大豆蛋白胨 ２％、ＭｇＳＯ４ ０．２％、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．１％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２％。
收稿日期： ２００７－ ０２－ ２８ 基金项目： 黑龙江省教育厅科学技术研究项目（ Ｎｏ． １０５４１１５０） 作者简介： 张丽萍， 女， １９５７ 年出生， 博士生， 教授 通讯作者： 马中苏
度 计 （ Ｔ６ 新 世 纪 ） ， 北 京 普 析 通 用 仪 器 有 限 公 司 ； 超级洁净工作台（ ＢＣＮ－ １３６０） ， 哈尔滨市东联电子 技 术 开 发 有 限 公 司 ； 压 力 蒸 汽 灭 菌 锅 （ ＹＸＣＥ． ＳＧ４１．２８０Ａ） ， 上海医用核子仪器厂 ； ｐＨ 计 （ ＳＧ２） ， 上海梅特勒－ 托利多仪器有限公司。 １．３ 培养方法
ｏｎ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｏｗｔｈ
第８卷 第１期
纳豆菌高产培养基的成分优化
３５
２．５ 离子组成对菌种生长的影响 ２．５．１ ＭｇＳＯ４ 质量分数 将基础种子培养基中的 ０．５％ ＮａＣｌ 用不同质量分数的 ＭｇＳＯ４ 替代， 其它 成分不变， 接种培养后每隔 ２ ｈ 测定生物量， 绘制 生长曲线。不同 ＭｇＳＯ４ 质量分数对菌种生长的影响 见图５。
一般来说， Ｇ＋对镁离子的需要量比 Ｇ－ 大。本试 验菌株为革兰氏阳性菌（ Ｇ＋） ， 因此， ＭｇＳＯ４ 浓度是 影响菌种生长的因素之一。 ２．５．２ Ｋ２ＨＰＯ４ 和 ＫＨ２ＰＯ４ 浓度 将基础种子培养 基 中 的 ０．５％ ＮａＣｌ 用 不 同 浓 度 比 的 Ｋ２ＨＰＯ４ 和 ＫＨ２ＰＯ４ 代替， 其它 成 分 不 变 ， 接 种 培 养 ， 每 隔 ２ ｈ 测定其生物量并绘制生长曲线 （ 见图 ６） 。由图 ６ 可 知 ， Ｋ２ＨＰＯ４ 与 ＫＨ２ＰＯ４ 的 适 宜 浓 度 比 为 １∶１， 在 培 养 １２ ｈ 时 达 到 最 大 生 长 量 ， 其 ＯＤ６００ 值 为 ２．２２２， 明显优于其它浓度比的， 且提前 ２ ｈ 达到最 大生长量。
１ 材料与方法
１．１ 材料 纳豆菌 Ｔ－ ３， 本研究室工作人员自行分离。 基础种子培养基： 牛 肉 膏 ０．３％、蛋 白 胨 １％、
ＮａＣｌ ０．５％， ｐＨ ７．２～７．４， １２１ ℃灭菌 ２０ ｍｉｎ。 １．２ 设备与仪器
恒温震荡培养箱（ ＨＧＣＥ－ Ｆ１６０） ， 哈尔滨市东 联电子技术开发有限公司； 电热恒温培养箱（ ＲＰ－ ９０８２） ， 上海森信实验仪器有限公司； 紫外分光光
分不变， 接种培养， 每隔 ２ ｈ 测定生物量并绘制生 长曲线。由图 ２ 可知， 大豆蛋白胨作为种子培养基 的氮源优于其它种类的氮源。菌种对无机氮源利 用 速 度 较 慢 ， 对 豆 粕 粉 的 利 用 速 度 更 慢 ， 其 ＯＤ６００ 一直处于较低的水平。
２．５
２．０
１．５
蛋白胨
大豆蛋白胨
１．０
优化培养： 在无菌条件下接种种子培养液至 装有一定量培养基的 ２５０ ｍＬ 三角瓶中， 恒温震荡 培养。 １．４ 生物量测定方法
发酵完成后， 取 １ ｍＬ 发酵液适当稀释， 以接 种前的培养基经同样方法稀释后作为空白， 用紫 外分光光度计测定菌液的 ＯＤ６００ｎｍ 值。
２ 结果与分析
２．１ 碳源种类对菌种生长的影响 将 基 础 种 子 培 养 基 中 ０．３％牛 肉 膏 更 换 为 同
ＫＨ２ＰＯ４ 的使用量采用五元二次旋转正交试验 （ １／ ２） 方法， 将单因素确定的适宜浓度作为零水平， 以 菌种培养 １４ ｈ 时的 ＯＤ６００ 为指标， 确定优化的培 养基组成。其因素水平编码及水平设置见表 １， 结 果见表 ２。
经双重显著性检验得到回归方程为： ｙ＝１．９８６＋０．０８２ｘ１－ ０．０４８ｘ２－ ０．０３８７ｘ４－ ０．０３９８ｘ５－ ０．０２１９ｘ２ｘ３－ ０．０２１５ｘ２ｘ５＋０．０２１１ｘ１２＋０．０２５６ｘ２２＋０．０３２６ ｘ３２＋ ０．０１９ｘ４２＋０．０１３８ｘ５２ 经 过 ２ 次 Ｆ 检 验 （ Ｐ＜０．０５） ， 该 方 程 拟 合 效 果 较好， 可作为优化模型。该方程局部最优点是最佳 的试验水平， 利用求偏导数的方法求解最优水平。
黑龙江大庆 １６３３１９）
摘要 为获得生长活力较强， 能够满足发酵生产纳豆激酶要求的菌种， 以 ＯＤ６００ 为评价指标， 采用测定菌种生长 曲线的方法优化培养基配比， 利用单因素试验确定适宜菌种生长的培养基成分， 并以得到的适宜条件作为五元 二次旋转正交设计的零水平进行系统优化。试验结果表明： 培养基成分的 最 优 组 合 为 葡 萄 糖 ３％、大 豆 蛋 白 胨 ２％、ＭｇＳＯ４ ０．２％、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．１％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２％。在优化条件下， 菌种培养 １４ ｈ 后菌液的 ＯＤ６００ 值可达到 ２．５４０， 较 优化前提高了 ０．６７４。
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中国食品学报
第８卷 第１期
表 １ 二次旋转（ １／２） 正交试验因素水平编码及水平设置 Ｔａｂｌｅ １ Ｆａｃｔｏｒ－ ｌｅｖｅｌ ｃｏｄｅ ａｎｄ ｌｅｖｅｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄ ｏｒｄｅｒ ｒｅｖｏｌｖｉｎｇ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
培 养 基 中 葡 萄 糖 质 量 分 数 固 定 为 ２％ ， ＮａＣｌ
３．０
２．５
２．０
２％葡 萄 糖
３％葡 萄 糖
１．５
４％葡 萄 糖
５％葡 萄 糖 １．０
０．５
０ ０ ４ ８ １２ １６ ２０ ２４ 培 养 时 间／ｈ