一、目的及要求
了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。

二、实验原理
在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。

在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。

感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。

农杆菌的感受态可用CaCl2 处理而诱导产生。

将正在生长的农杆菌细胞在加入到低渗的氯化钙溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。

制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大影响。

三、实验仪器、材料和试剂
仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml 试管，50ml 离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。

以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。

材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株
试剂：
YEB 液体培养基（1升）：酵母提取物1g ，牛肉膏5g ，蛋白胨5g ，蔗糖
5g ，
MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0，高压灭菌；
链霉素（Sm ）储液：125mg/ml
0.15 N NaCl，高压灭菌。

20mM CaCl2，高压灭菌。

四、实验步骤
1. 挑取根癌农杆菌LBA4404 单菌落于3ml 的YEB 液体培养基（含Sm
125mg/l）中，28°C 振荡培养过夜；
2. 取过夜培养菌液0.5ml 接种于50mlYEB(Sm 125mg/l液体培养基中，28°C 振荡培养至OD600为0.5；
3. 5000rpm, 离心5min ；
4. 加入10ml 0.15N NaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，5000rpm, 离心5min ；
5. 弃上清，置于冰上，加入1ml 预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24小时内使用，或分装成每管200ml ，液氮中速冻1 分钟，置70°C 保存备用。