农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤发布日期：2010-04-28 发布
人:technew最后更新时间:2010-04-28 浏览次数:889
一、目的及要求
了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。
二、实验原理
在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。
在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。
感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。
农杆菌的感受态可用CaCl2 处理而诱导产生。
将正在生长的农杆菌细胞在加入到低渗的氯化钙溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。
制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大影响。
三、实验仪器、材料和试剂
仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml 试管，50ml 离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。
以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。
材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株
试剂：
YEB液体培养基（1升）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，
MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0，高压灭菌；
链霉素（Sm）储液：125mg/ml
0.15 N NaCl，高压灭菌。
20mM CaCl2，高压灭菌。
四、实验步骤
1. 挑取根癌农杆菌LBA4404 单菌落于3ml 的YEB液体培养基（含Sm 125mg/l）中，28°C振荡培养过夜；
2. 取过夜培养菌液0.5ml接种于50mlYEB(Sm 125mg/l)液体培养基中，28°C振荡培养至OD600为0.5；
3. 5000rpm, 离心5min；
4. 加入10ml 0.15N NaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，5000rpm, 离心5min；
5. 弃上清，置于冰上，加入1ml预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24小时内使用，或分装成每管200ml，液氮中速冻1 分钟，置70°C保存备用。
一．农杆菌感受态细胞的制备
二．双元载体转化农杆菌EHA105
三．杆菌转化子的鉴定
A．农杆菌转化子的PCR鉴定
B．农杆菌转化子的酶切鉴定
关键词：农杆菌感受态细胞转化子
一．农杆菌感受态细胞的制备（同大肠杆菌质粒DNA的提取），然后将其转化大肠杆菌，再提取大肠杆菌的质粒DNA进行酶切鉴定。
取-70℃保存的EHA105于含有50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养2天。
挑单
菌落接种于5ml YM（0.5g/L KH
2 PO
4
,10 g/L Mannitol,2 g/L L-Glutamine,0.2
g/L NaCL,0.2 g/L MgSO
4,0.3 g/L Yeast extract,PH
7
.0）液体培养基中，220rpm，
28℃振荡培养18 hr 左右。
将5ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，
28℃,220rpm,振荡培养至OD
600
=0.5。
转入无菌1.5ml的EP管，5000g离心5min,
去上清液。
加入1ml预冷的0.1M的CaCl
2
溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min，
4℃下，5000g离心5min，去上清。
加入200µl预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl
2溶液，轻轻悬浮。
混匀后立即冻存于-80℃。
二．双元载体转化农杆菌EHA105
取1µg左右的质粒DNA加入到200µl EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min；-70℃放置10min ；取出后37℃水浴5min或42℃水浴1min；冰浴2min；加入800µl YM液体培养基,28℃，175rpm摇培3hr；取出后涂在含50μg/ml Kanamycin 的YM平板上，28℃培养到形成单菌落。
三．杆菌转化子的鉴定
A．农杆菌转化子的PCR鉴定
挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50µg/ml Kanamycin的YM液体培养基中，28℃，220rpm摇培16hr，直接用菌液做PCR。
PCR反应体系如下：
反应组分体积终浓度母液浓度
农杆菌转化子菌液2µl
P1 (35S) 2µl 200nM 2µM
P2 (GUS) 2µl 200nM 2µM
10 ×PCR Buffer 2µl
Mg2+ 1.2µl 1.5mM 25mM
d NTP 1.2µl 150µM 2.5mM
Taq酶0.2µl 1U 5U/µl
H
O 9.4µl
2
20µl
PCR反应参数设置如下：94℃预变性3min 后开始以下循环反应：94℃变性30秒，50℃退火1min ，72℃延伸1min，35个循环后，72℃延伸10min。
反应结束后，取10µl反应液在1.0 %琼脂糖凝胶中电泳扩增产物。
B．农杆菌转化子的酶切鉴定
提取农杆菌质粒DNA（同大肠杆菌质粒DNA的提取），然后将其转化大肠杆菌，再提取大肠杆菌的质粒DNA进行酶切鉴定。