蒽酮-硫酸法测残糖含量
(1)原理
糖类与浓硫酸脱水生成糖醛或其衍生物,可与蒽酮试剂缩合产生颜色物质,反应后溶液呈蓝绿色,于620nm处有最大吸收,显色与多糖含量有线性关系。
(2)试剂
①蒽酮试剂。
溶解0.2g蒽酮于浓硫酸(A.R.95.5%)100ml中,当日配制试用。
具体实验
过程中,应视样品分数多少来准备蒽酮试剂的配置量。
比如实测样品有50份,为了保证结果的可靠性,安排个份样品试验重复数为3。
因为每个试验点实测需要4ml蒽酮试剂,所以至少应配置的体积为4×3×50=600ml。
此时还应考虑预实验和实验差错所消耗蒽酮试剂量。
②标准糖试剂。
葡聚糖溶液(可加数滴甲苯防腐)
(3)操作及其注意事项
分别取0.1g/l的葡萄糖溶液0.05,0.10,0.20,0.30,0.40,0.60,0.80ml,用蒸馏水补到1.00ml,分别加入4.00ml蒽酮试剂,迅速进入冰水浴中冷却,各管加完后一起浸入沸水浴中,管口加盖玻璃球,以防蒸发。
自水浴重新煮沸开始计时,准确煮沸10min,冷却后进行比色。
以光密度为纵坐标,糖的含量微克数为横坐标,制作标准曲线。
或使用计算器进行一元回归得出计算式,以便于计算使用。
(4)样品含量测定
取糖浓度为50μg/ml左右的样品溶液1.00ml,一式3份分别置于不同试管中,对照加入1.0ml 蒸馏水,然后给各管加入蒽酮试剂,以标准曲线方法进行比色测定。
根据标准曲线和样品浓度计算含量。
色氨酸含量较高的蛋白质对显色反应有一定的干扰。
此外,试管在加入蒽酮试剂过程中,移液管尖端在试管中所停留的高度对于加入蒽酮试剂的速度影响较大,而且对反应产生颜色的深浅都会产生一定的影响。
因此,实验操作应该注意。