(ⅱi). 将mRNA-DNA杂交分子转变为双链cDNA分子 用碱处理使mRNA模板水解掉，从而导致第一条cDNA链解
离；末端发夹结构作为第二条链合成的引物，用S1核酸酶切割 除去发夹结构
(ⅳ). 将合成的双链cDNA重组到质粒载体或噬菌体载体上，导 入大肠杆菌寄主细胞增殖
重组的方式：先用末端转移酶给双链cDNA分子加尾，或 将人工合成的衔接物加到双链cDNA分子的两端，而后再同经 适当处理而且有相应粘性末端的载体分子连接
(ⅱ) 合成第一条cDNA链
A. oligo(dT)引导的cDNA合成法 缺点：它必须从3ˊ-末端开始，反转录酶无法到达mRNA分 子5ˊ-末端
B. 随机引物引导的cDNA合成法 原理：根据许多可能的序列，合成出6-10bp的寡核苷酸短片 段混合物，作为合成第一条链cDNA的引物。在应用这种混 合引物的情况下，cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位 点同时发生，而不仅仅从3ˊ-末端的oligo(dT)引物一处开始
注：理论克隆数：供体生物的基因组DNA总量/克隆片段的平均大小 实际克隆数：按照Clarke-Carbon公式计算的
4.3.1 互补作用基因克隆
如果被克隆的DNA片段，同重组体DNA分子的寄主细胞的 染色体DNA是同源的，那么使用互补作用进行基因克隆，将是 一种十分有效的方法。
最简单的方式：将大肠杆菌DNA的克隆片段“库”，即一 组含有大肠杆菌基因组全部DNA序列结构的重组体DNA分子的 异源群体，导入一种大肠杆菌营养缺陷型菌株的受体细胞。然 后将此受体细胞涂布在一种缺少该菌株所需的底物的基本培养 基上。因此，只有那些获得了营养缺陷型互补基因的受体细胞 才能会长成转化子菌落。
♣ cDNA克隆的基本过程： 通过一系列的酶催化作用，使总poly(A) mRNA转变成双链
cDNA群体，并插入到适当的载体分子上，然后再转化到大肠 杆菌寄主菌株的细胞内
GGG
限制酶
末端转移酶 dGTP
GG
5ˊ
AAAAAA 3ˊ
Oligo(dT)引物
5ˊ
AAAAAA 3ˊ
反转录酶 TTTTT
NaOH降解mRNA链， DNA聚合酶I
4.3.3 应用mRNA差别显示技术分离克隆的目的基因
根据表达特性的差异可将高等真核生物的基因分为： 看家基因：以组成型表达模式维持细胞的基本代谢活动 发育调控基因：以时空特异性表达模式完成个体的正常的 生长、发育和分化。
真核生物基因总数为100 000个，在一定发育阶段只有15% 基因得以表达，产生出15 000种mRNA分子，其中相当一 部分属于发育调控基因，起左右全局的作用。
Pst I
pGGCC ACGTCCGG
GGCCTGCAGG CCGGACGTCCp
GGCCTGCA CCGGp
附加衔接物
HO
OH
5ˊ HO-GATCCCCGGG-OH HO p
p HO

OH p
3ˊ
HO-GGGCCC-P HO
OH
HO p
T4 DNA连接酶 ATP
HO HO
OH OH
多核苷酸激酶 ATP
■ 非互补或平末端DNA分子的连接： ♣ 附加衔接物（接头） ♣ 同聚物加尾
Pst I 衔接物
CCTGCAGG GGACGTCC
GGCC CCGG
T4多核苷酸激酶 ATP
pCCTGCAGG GGACGTCCp
Hae III
pCC GG
T4 DNA连接酶
GGCC CCGG
GG CCp
pCCTGCAGGCC GGACGTCCGG
SI核酸酶降解发夹结构
CCC
末端转移酶，dCTP CC以质粒为载体构建cDNA♣ cDNA构建的步骤
(i) 分离细胞总RNA，然后从中纯化出主要含mRNA的部分 纯化的原理及步骤： 一段仅由脱氧胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸 [oligo(dT)],能够同惰性物质如纤维素(或琼脂糖)结合。当 细胞总RNA通过已经用[oligo(dT)]处理过的纤维素柱时， mRNA分子的poly(A)尾巴便会同[oligo(dT)]序列杂交而粘 附到柱子的填充物纤维素上，而其余的rRNA及tRNA分子 则流出柱子。先用100mM NaCl缓冲液广泛洗涤纤维素柱， 以清除全部污染的rRNA和tRNA分子，而后再用低离子强 度的10mM Tris- 1mM EDTA缓冲液洗涤。 mRNA分子占细胞总RNA的1%-2%
♣ cDNA克隆的优点
第一：cDNA克隆以mRNA为材料，这对于有些RNA病毒， 如流感病毒和呼肠孤病毒来说特别的适用。这些病毒的增 殖不经过DNA中间体，故cDNA克隆是DNA克隆都含有一种mRNA序列，故在选择 中出现假阳性的几率比较低
基因分离的方法： 应用核酸探针、差别杂交或扣除杂交、 mRNA差别显示技术、酵母双杂交体系
4.3.2 应用差别杂交和扣除杂交法分离目的基因
差别杂交(differential hybridization)
适用范围：分离在特定组织中表达的基因、在细胞周期特定 阶段表达的基因、受生长银子调节的基因、在特定发育阶段 表达的或是参与发育调节的基因，同时也用来分离经特殊处 理而被诱发表达的基因
1 23 456 7 8 9 12 3 4 5 6 7 8 9
4.2 重组体DNA分子的构建及导入受体细胞
4.2.1 外源DNA片段同载体分子的重组
■ 考虑因素： ♣ 实验步骤要尽可能简单易行； ♣ “接点”能被一定的内切酶重新切割； ♣ 对转录和转译过程中密码子的阅读不发生干扰
■ 外源DNA片段定向插入载体分子：
4.3.2 cDNA基因克隆
♣ 为什么要进行cDNA基因克隆： 真核生物基因组DNA十分庞大，其复杂度是蛋白质和
mRNA的100倍左右，而且含有大量的重复序列 高等生物的基因数量一般在105左右，但在一定时间阶段
的单个细胞或个体中，都仅有15%左右的基因得以表达，产生 出约15 000种不同的mRNA分子
技术基础：不需要任何有关目的基因的核苷酸序列信息，只 要拥有两种不同的细胞群体：在一个细胞群体中目的基因正 常表达，而在另一个细胞群体中目的基因不表达
操作步骤：
制备两种不同的mRNA提取物：其一，含有一定比例的目的 基因mRNA种的总mRNA的总mRNA群体；其二，不含有目 的基因mRNA种的总mRNA群体。通过这两种总mRNA(或 是它们的cDNA拷贝)为探针进行平行杂交，对由表达目的基 因的细胞总mRNA构建的克隆库进行筛选
制备poly(A) mRNA
加oligo(dT)32p-dNTPs 反转录酶，制备cDNA
cDNA
与λ载体重组 感染大肠杆菌 构建cDNA制备poly(A) mRNA
加oligo(dT)32p-dNTPs 反转录酶，制备cDNA
含目的基因的阳性克隆
差别杂交的局限性：
♣ 灵敏度低，特别是低丰度的mRNA ♣ 耗时耗力，费用高 ♣ 重复性差
扣除杂交：
除去那些普遍共同存在的、或是非诱发产生的cDNA 序列，从而使欲分离的目的基因的序列得到有效的 富集，提高了分离的敏感性
制备poly(A) mRNA
加oligo(dT) dNTPs 反转录酶，制备cDNA
杂交
制备poly(A) mRNA
羟基磷灰石柱
单链 cDNA 双链 cDNA
与λ载体重组，感染大肠杆菌构建cDNA2 ×106 (细菌) 理论 实际
400 1831
200
919
100 458
50 278
基因组的大小（bp）
2 ×107(真菌)
理论
实际
3 ×109(动物) 理论 实际
4000 2000 1000 500
18418 9208 4603 2300
600 000 2 763 110 300 000 1 381 550 150 000 690 774 75 000 345 386
■ 产生片段群体要求： ♣ 必须包容整个基因组的全部序列； ♣ 高纯度； ♣ 大小适合基因操作。
■ 产生片段群体方法： ♣ 机械切割（超声波；搅拌器高速搅拌） ♣ 限制性内切酶（单酶、双酶）
。
4.1.2 DNA片段的大小分布■ 构建完全基因： ♣ 不做特殊处理；或者脉冲电泳
■ 编码目的基因的克隆片段的富集： ♣ 琼脂糖凝胶电泳 ♣ 蔗糖梯度离心
p
OH
HO
p
同聚物加尾
4.2 重组体DNA分子的构建及导入受体细胞
4.2.1 外源DNA片段同载体分子的重组
■ 最佳连接反应： ♣ 载体DNA和外源DNA之间的比例； ♣ DNA的总浓度；
低浓度的DNA(20μg/ml)，自连 高浓度的DNA(300~400μg/ml)，多连体分子
♣ 连接温度
4.2 重组体DNA分子的构建及导入受体细胞
例子：从人类基因组DNA(3 ×106)，克隆β-珠蛋白基因(1.5 kb)
ln (1-0.99) N = ln [1- (1.5/3 ×106)] = 9隆片段 的平均大 小(bp)
5×103 10×103 20×103 40×103
第四：自身的特殊用途 克隆在细菌中表达的基因 和用作基因序列结构的测定
4.3.3基因组DNA克隆
4.4 克隆基因的分离
基因组测序
A. 耗资巨大，一般发展中国家(实验室)的财力难以承受 B. 基因组中的大部分序列并无重要的生物学功能 C. 一些具有理论研究和生产应用价值的基因，例如人类的疾
病控制基因，仅占基因组全序列的极少部分，按部就班的 测序不可能优先筛选出这类基因 D. 农业生产和医疗临床实践都迫切要求尽快分离到有关的重 要基因
第四章 基因的分离与鉴定
♣ 1. DNA克隆片段的产生与分离 ♣ 2. 重组体DNA分子的构建及导入受体细胞 ♣ 3. 基因克隆的实验方案