➢ 如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表 达型载体；
3.转化受体细胞
➢ 如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能 使目的基因表达的受体细胞；
➢ 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法 筛选，则选择大肠杆菌作为的受体细胞。
4.筛选含有目的基因的目的重组子
➢ 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的 建立）
30ul溶液III至管内柱面上，放置1分钟； 10.高速离心1分钟，所得液体即为高纯度DNA。
(三)鸟枪法克隆目的基因的局限性
工作量较大，需要了解目的基因的背景知识 不能获得最小长度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的内含子结构
二、cDNA法
cDNA法克隆目的基因的基本战略 cDNA法分离目的基因的基本程序 cDNA法克隆目的基因的局限性
该基因的功能或序列并不一定要了解。
3、基因分离
从复杂的基因组中分离出单个具特定功能或特性的基 因或DNA片段。
❖基因工程或DNA重组技术的前提条件是从生物 体基因组中分离克隆目的基因。
➢确定其表达调控机制和生物学功能； ➢建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌 （细胞）； ➢将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰； ➢然后转入受体细胞内改良生物体的遗传性状，包括人 体基因治疗。
一、 鸟枪法
鸟枪法克隆目的基因的基本战略 鸟枪法操作的改进 鸟枪法克隆目的基因的局限性
(一)鸟枪法克隆目的基因的基本战略
鸟枪法（shot-gun approach)：随机克隆供体细胞 的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程 序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子， 进而获得目的基因。
鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离。
1.染色体DNA的切断
➢超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端； ➢全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有 可能使目的基因断开，大小不可控；
➢部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基 因完整。
2.与载体连接
➢ 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法 筛选，则选择多拷贝克隆载体；
(二) 鸟枪法操作的改进
使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA
使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切 图谱已知。 如果已知目的基因两端的酶切位点，可用该酶处理 染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基 因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频 率。
在连接前将DNA片段进行分级分离
❖一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合 成目的基因，然后将之克隆表达。
第一节 目的基因的克隆
A 鸟枪法 B cDNA法 C PCR法 D 化学合成法 E 基因的构建❖凝胶DNA片段回收程序
1.切胶回收于离心管中； 2.加入等体积的溶液I； 3.50-60℃水浴加热约10分钟至胶融解； 4.加入到DNA纯化柱内，室温放置1分钟； 5.离心1分钟，倒弃收集管内的液体； 6.加入700微升溶液II，室温放置1分钟； 7.离心1分钟，洗去杂质； 8.加入500微升溶液II，最高速离心1分钟； 9.将DNA纯化柱置于1.5ml离心管上，加入
(二) cDNA法克隆目的基因的局限性
并非所有的mRNA分子都具有polyA结构 细菌或原核生物的mRNA半衰期很短 mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感， 分离纯化困难 仅限于克隆蛋白质编码基因
三 PCR法
(一)PCR法定向扩增目的基因的基本原理
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基因工程
6 目的基因的克隆与分离鉴定
目的基因的克隆 目的基因的分离鉴定
❖基因克隆与基因分离
个体水平上的克隆 1、克隆 细胞水平上的克隆
分子水平上的克隆
2、基因克隆
分子水平上的克隆，将某一段DNA或一个基因插入到 一个载体分子上，并导入特定的宿主细胞中，形成寄 主/载体单元，称为一个克隆。
例如，已知某目的基因位于1.8 kb 的SalI片段中，将染色体DNA用SalI 切开，琼脂糖凝胶电泳分离；
用刀片切下相当于1.6 - 2.0 kb大小 区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收 DN kb
1.8 kb
❖凝胶DNA片段回收技术
冻融法 滤纸法 吸附法 低融点凝胶法 溶解法
问题
鸟枪法获得的克隆群体庞大
以人的基因组为例，如果载体承受外源DNA片段 的能力为1-3kb；那么,人类基因组DNA需被切割成 几十万个大小不等的片段；
每个片段都分别插入到一个载体分子上，这样就 会形成由几十万个不同的重组分子组成的克隆群体；
要想从如此巨大的克隆群体中筛选带有目的基因 的克隆，显然是非常费事的。
引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列
G 5‘ppp’5 G 3‘HO
G 5‘ppp’5 G 3‘ HOCCCCCCC
3‘ HOCCCCCCC 5‘ pGGGGGGG
3‘ HOCCCCCCC 5‘ pGGGGGGG
TdT NaOH Klenow
dCTP 退火 dNTPs
AAAAAOH3’ TTTTTp5’
(一) cDNA法克隆目的基因的基本战略
1.cDNA第一链的合成
G 5‘ppp’5 G
mRNA
引物 退火
G 5‘ppp’5 G
逆转录酶
dNTPs
G 5‘ppp’5 G
cDNA第一链
AAAAAAAAAAAAAAOH3’
AAAAAAAAAAAAAAOH3’ TTTTTTTTTTTTTTp5’
AAAAAAAAAAAAAAOH3’ TTTTTTTTTTTTTTp5’
AAAAACCCCCCCOH3’ TTTTTp5’
TTTTTp5’
TTTTTp5’ AAAAAOH3’
3.双链cDNA的克隆
双链平头的cDNA与载体的连接： 平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾， 这样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理 回收插入片段 加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收