AlBlCl AlB2C2 AlB3C3 A2B2C3 A2B3C1 A2B1C2 A3B3C2 A3BlC3 A3B2C1
95．00±1．6971a 52．12±2．9698c 61．82±1．5556b 36．36±2．2627f 23．03±2．4042h 48．48±1．9799d 25．00±1．8385g 24．24±1．9799g 46．06±1．5556e
实验方法是将乳酸菌培养液 40ml 离心后的
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沉淀物 (保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌比例 1：1) 用 10ml 生理盐水完全溶解，在旋涡混合器上将此 溶液混合均匀， 每个样品取 3ml 此溶液与等体积 的不同的保护剂溶液混合， 在-80°C 冰箱中冷冻 24h， 在 自 然 条 件 下 使 样 品 解 冻 ， 分 别 测 定 冷 冻 前 和冷冻后每 m1 溶液中的菌体数目， 最终得到冷 冻存活率，从而选取保护效果好的保护剂，包括保 护剂的浓度。
1.2.1 正 交 实 验 这 部 分 要 列 出 因 素 水 平 表，格式如下表为准：
表 1 保护剂正交设计表
序号
1
2
3
4
Байду номын сангаас
名称
蔗糖 A 空列 D 脱脂奶 B 谷氨酸钠 C
水平 1 % 10.0
10.0
5.0
水平 2 % 12.5
5.0
7.5
水平 3 % 15.0
7.5
10.0
1．2.2 测定方法 冷 冻 存 活 率％=(冷 冻 后 溶 液 中 的 活 菌 数 ／ 冷
有 报 道 称 [2]如 果 将 乳 酸 菌 培 养 液 直 接 进 行 冷 冻干燥，其存活率仅有 10%~30%左右。 但是干燥 过程对乳酸菌的损伤程度比较小， 冷冻是引起乳
酸菌死亡的主要环节。 菌体冷冻干燥的存活率受 多方面的影响，包括起始的细胞菌液浓度，保护介 质和再水合条件[3]，其中保护介质的添加是一个重 要环节。 一种保护效果好的保护剂要求在冷冻干 燥过程中可以提供保护作用， 并且有良好的自身 稳定性和有利于再水合， 还可以方便有效除去冻 干材料中的多余溶剂。 关于保护剂的报道也有很 多，比较常用的有蔗糖、乳糖、脱脂乳和谷氨酸钠， 但大多是针对单菌种的， 对混菌的保护剂研究较 少。另有国外文献报道[4]浓度为 1%~68％的蔗糖溶 液可作为冷冻保护剂， 它可以用于杆菌和球菌的 保护剂，原因是蔗糖可以抑制表面自由基的产生， 对菌体细胞有较好的保护作用。 在-20°C~-70°C 保存发酵剂时， 乳糖浓度在 1%~10%的溶液比甘
冻前溶液中的活菌数)×100
2 结果与分析
单因素保护剂实验结果见表 2。 表 2 保护剂单因素实验结果(n=2)
保护剂
5％蔗 糖 10%蔗 糖 15％蔗 糖 5％脱 脂 乳 10%脱 脂 乳 15％脱 脂 乳
混菌冷冻存 活率
保护剂
混菌冷冻存 活翠
55±2．8284bc 5％谷氨酸钠 64±5．6569a
乳浓度为 10％，谷氨酸钠浓度为 5％，冷冻后菌体 细胞的混菌冷冻存活率可达到 95．00％，用显微镜 观察杆菌球菌比例维持在 1：1~1：1．5， 比例与原 样中杆菌和球菌的比例略有升高， 这主要是由于 保加利亚乳杆菌是对冷冻干燥敏感的菌种， 而嗜 热链球菌对冷冻的敏感程度相对较低。冷冻时，培 养液中杆菌的死亡率比球菌高。
实验中选取了对两种单菌 (保加利亚乳杆菌 和嗜热链球菌)都有冷冻保护效果的蔗糖、乳糖、 脱脂乳和谷氨酸钠来进行实验。 有报道称影响菌 体存活率的主要因素是冷冻速率。在缓慢冷冻时， 胞外基质一般较快结冰而形成冰晶使基质浓度增 高，造成细胞水分外渗而大量脱水，可能使细胞死 亡。 如果快速降温，胞内也很快形成冰晶，胞内外 渗透压基本平衡，同时胞内冰晶较小，对细胞及原 生质膜的损伤也较小， 菌株不易死亡， 影响也较 小。 如在-79℃、-196°C 冻结时菌体细胞的存活率 高达 90%以上。 刘振民，骆承庠研究发现[6]，在冷 冻 过 程 中 存 在 两 个 冰 晶 生 成 带 ， 即 0°C~-3.7°C 和-30°C~-37.4°C。 快速通过冰晶生成带可以减小 菌体的冷冻损伤。为了满足上述条件，可以在超低 温冰箱中冷冻样品，温度设定为-80℃。 对照组(不 添加保护剂)存活率为 12％，冷冻存活率低的原因 是这个过程使较敏感的蛋白质变性， 降低了细胞 活 性 [5]。
第 40 卷第 3 期 2011 年 7 月
发酵科技通讯
乳酸菌冷冻保护剂配方设计
杜磊 1 乔发东 2 (1.安阳工学院生物与食品工程学院 河南安阳 455000;
2．河南工业大学生物工程学院 河南郑州 450000)
摘 要：乳酸菌浓缩发酵剂的制备过程中，冷冻对菌体的损伤比较明显。 通过在保加利亚乳杆菌和 嗜热链球菌混菌菌悬液中添加不同的保护剂并测定冷冻前后乳酸菌菌数， 筛选出适用的保加利亚乳杆 菌和嗜热链球菌混菌的保护剂。最终确定的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混菌保护剂配方为：蔗糖浓度 为 10％，脱脂乳浓度为 10％，谷氨酸钠浓度为 5％。 菌体经冷冻处理后，冷冻存活率可达到 95．0％，比不添 加保护剂的菌体存活率大大提高。 此配方也简单易得，完全可以满足生产需要。
1 材料与方法
1．1 材料与试剂 1，1．1 MRS 固 体 培 养 基 ： 蛋 白 胨 1％， 牛 肉 膏 1％，酵母膏 0．5％，葡萄糖 2％，吐温 80 ml，磷酸二 氢钾 0．2％，醋酸钠 0．2％，柠檬酸三铵 0.2％，硫酸 镁 0.02％，硫酸锰 0.05％，琼脂 1．5％。 1．1．2 脱脂乳粉由圣元乳业有限公司生产。 1．1．3 氯化钠、乳糖、蔗糖、谷氨酸钠均为生化级。 1．1．4 玻璃仪器：试管，移液管，平板，安瓿瓶等。 1．1.5 净化工作台 SW—VJ—1FD。 1．1．6 小型旋涡混合器。 1．1．7 高压灭菌器 HVE—50(日本 HIRAYAMA)。 1．1.8 显微镜 NIKON 50i。 1．1．9 超低温冰箱 DW—HL218(中科美菱)。 1．1．10 恒温培养箱 SKG02．420(黄石市恒丰医疗 器械有限公司)。 1．1．11 超纯水机 KL—UP—III—10 (台湾艾柯)。 1．2 试验条件
60±4．2426ab 10％谷氨酸钠 58±2．8284abc
62±4．2426ab 15％谷氨酸钠 45±2．8284d
36±2.8284e
5％乳 糖
45±4．2426d
51±2.8284cb 10％乳糖 50±1．4142cd
58±4．2426abc 15％乳糖 55±2.8284bc
表 2 中的数据可以看出， 蔗糖浓度为 10％、 15％的 溶 液 ，脱 脂 乳 浓 度 10％、15％的 溶 液 ，谷 氨 酸钠浓度为 5％、10％的溶液， 乳糖浓度为 10％、 15％的溶液菌体细胞存活率比较高， 结果与吕加 平，骆承庠的研究结果相似。 在单因素的条件下， 最好的保护剂是浓度为 5％谷氨酸钠溶液， 其保 护效果可以达到 64％。 考虑到乳糖和蔗糖同属于 糖类，其保护机理应当相似，而蔗糖与乳糖在浓度 一样的情况下， 蔗糖溶液的保护效果比乳糖溶液 的保护效果明显更好，且蔗糖易得到，而乳糖的成
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第 40 卷
油有良好的保护性。 浓度为 1%~10%的脱脂乳溶 液也可作为乳酸菌的冷冻保护剂。 脱脂乳可以成 为 保 护 剂 的 原 因 是[5]:提 高 了 细 胞 的 稳 定 性 以 降 低 细胞损伤；创造了一个多孔的环境有利于再水合； 含有大量的蛋白质给细胞提供了保护性的外衣。
第 40 卷第 3 期 2011 年 7 月
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本也较高，所以选择蔗糖进行正交实验。 以上物质可能有协同的保护作用， 所以设计
了 4 因素 3 水平的正交试验。 正交设计表见表 1。 正交设计后的冷冻存活率的试验结果见表 3。 表 3 保护剂正交试验结果（n=2）
试验序号
混菌冷冻存活率 ％
Key words：Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus, freeze protective agent
在乳酸菌浓缩发酵剂的制作过程中， 由于冷 冻时对乳酸菌的破坏较大， 所以冷冻保护剂的选 择一直是浓缩发酵剂制备中的一个关键。
Kilara[1]认为当初始细菌浓度 越 大 时 ，冷 冻 干 燥获得较高存活率的几率就越大， 这主要是通过 降低了单个菌体细胞暴露在介质中的面积来达到 保护的效果。 在实际生产中尽量通过提高初始细 菌浓度来提高菌体的冷冻干燥时的存活率， 从而 减小菌体的死亡和损失。 这也正是以上培养和离 心过程中要求单位体积的培养基中菌体数目 (细 菌浓度)的原因。
对表 3 中的数据进行正交方差分析， 各列的 级 差 分 别 为 ：37．88、18．99、19．29、13．89，空 列(第 2 列)的级差并没有比其它列的级差都大，所以这三 种物质协同作用不明显， 不同物质溶液的保护效 果为蔗糖溶液>脱脂乳溶液>谷氨酸钠溶液，相同 的溶液不同浓度之间保护效果蔗糖：10％>12．5％> 15％； 脱 脂 乳 ：10％>5％>7．5％； 谷 氨 酸 钠 ：5％> 7．5％>10％。 同时还发现有些试验结果反映，由 3 种不同物质组成的保护剂的保护效果还不如单因 素的保护效果好， 这可能是由于保护剂的配比不 合理所致，但效果都比对照组(不添加保护剂)好。 效果最好的保护剂配方是蔗糖浓度为 10％，脱脂
3 结论
用此配方制备的保护剂对保加利亚乳杆菌和 嗜热链球菌混菌保护效果良好，并且方便易得，在 工业化生产乳酸菌浓缩发酵剂时也可使用。
参考文献：
[1]Kilara， A， Shahani， K.M． and Das． N． K. Effect Of cryoprotective agents On freeze -drying and strorage Of lactic culture． Cult．Dairy Prod·，1976，(11)：8 [2]徐 成 勇 ，郭 本 恒 ，吴 昊 等．酸 奶 发 酵 剂 和 乳 酸 菌 生 物 技 术 育 种 ．中 国 生 物 工 程 杂 志 ，2004，24(7)：55—59 [3] E.costa， J usall． N． teixido， N· Garcia and I． vinas． Effect of protective agents，rehydration media an initial cell concentration on viability of pantoea agglomerants strain CPA -2 subjected to freeze-drying．Journal of applied microbiology，2000， (89)：793～800 [4]Zdenek hubalek．Protectant sused in the cryopreservation of microorganisms．Science direct， 2003，(46)：205-229