流加发酵与高密度培养
流加发酵
所 谓 流 加 发 酵 ， 即 补 料 分 批 发 酵 (Fedbatch fermentation)，有时又称半连续培 养或半连续发酵，是指在分批发酵过程 中间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵 方法
分批、连续、流加操作方式的比较
分批发酵 连续发酵
流加发酵
优点 1.一般投资较小 2.易转产、生产灵活 3.分批操作中某一阶段可获得高的 转化率 4.发酵周期短，菌种退化率小 1.可实现有规律的机械、自动化 2.操作人员少 3.反应器体积小、非生产时间少
在菌体生长阶段采用指数速率流加法的
几点假设如下： (a) 发酵罐内为理想混合； (b) 葡萄糖为唯一限制性碳源； (c) 残留菌体对葡萄糖的产率系数(YX/s)为常 数； (d) 菌体生长遵循Monod方程。
对底物葡萄糖进行衡算，则：
d(VS ) dt
FS0
(
Yx / s
ms ) VX
F为体积流加速率(L/h)，S0为流加液中基质浓 度(g/L)，Yx/s为菌体对底物的产率系数(g/g)， ms 为细 胞比维 持系数 (g/g/h) ， X为菌体 浓度 (g/L)，V为培养液体积(L)，μ为菌体比生长速 率(h-1)。
1. 流加发酵类型
流加发酵的分类
类别
流加方式
无反馈控 制
反馈控制
恒流量流加、变流量流加和间歇流加
直接控制流加、间接控制流加 定值控制流加、程序控制流加、最优控制流 加
2. 采用流加发酵应该解决的关键问题
(1) 流加什么物质？
①补充微生物能源和碳源，如在发酵液中添加 葡萄糖、 饴糖、液化淀粉。作为消泡剂的天然油 脂，有时也能同时起到补充碳源的作用
及产物对底物的产率系数(Yp/s)
4. 合适的流加发酵类型的确定 a.恒速流加(包括单一速率和分阶段恒速流加) b.指数速率流加 c.底物在线测定后的反馈流加
(如葡萄糖反馈流加) d. pH-stat e. DO-stat
5. 流加方式的应用 (1) 恒速流加
采用恒流速流加培养时，可得到如下 的物料平衡方程式：
1.非生产时间长 2.需较多的操作人员或计算机控制系统 3.操作人员接触一些病原菌和有毒产品的可 能性大
流加发酵的研究进展
在20世纪70年代以前流加发酵的理论研 究几乎是个空白，流加过程控制仅仅以 经验为主，流加方式也仅仅局限于间歇 或恒速流加
1973年日本学者Yoshida等人首次提出了 “Fed-Batch Fermentation”这个术语， 并从理论上建立了第一个数学模型，流 加发酵的研究才开始进入理论研究阶段
②补充菌体所需要的氮源，有机氮或氨水
③加入某些微生物生长或合成需要的微量 元素或无机盐
④加入酶合成诱导物或前体物质
(2) 如何流加？ a.底物流加速率 b.流加开始时间及总流加时间 c.需控制的底物浓度
3. 流加发酵过程中某些重要参数的确定 a. 最佳底物浓度的确定
(包括菌体生长阶段和产物合成阶段) b. 底物的消耗速率 c. 菌体比生长速率() d. 菌体对底物的产率系数(Yx/s)
流加发酵所取得的三个方面的重大进展
20世纪70年代中后期对流加发酵过程的 动力学解析
结合发酵过程的可测参数对流加过程进 行反馈控制（如DO法、CO2法、RQ(呼吸 商)法、pH法、代谢物法、萤光法等）
流加发酵的最优化研究
流加发酵最优化研究的核心问题是找出 最佳的底物流加方式，以维持发酵过程 始终处于最佳状态
V
dБайду номын сангаас dt
S dV dt
F S0
(
Yx / c
m) V X
对菌体量的变化进行物料衡算，则：
d(XV) XV
dt
假定为常数，则上式积分可得：
XV X F VF e (ttF )
由于生长符合Monod方程
m S
Ks S μ是S的函数，要使μ恒定，S必须 恒定，则有：
dS 0 dt
流加发酵最优化的研究内容包括：
（1）状态方程的建立 （2）目标泛函的确定 （3）最优化底物流加方式的求解
流加发酵的物料衡算式可以表达为：
d ( XV ) XV
dt
d (SV dt
)
XV
SF
F
d (PV ) XV
dt
dV F dt
流加发酵的最优化理论有：格林原理、庞特里金最小值 (最大值)原理等
4.产品质量稳定 5.操作人员接触毒害物质的可能性 小 6.测量仪器使用寿命长 1.操作灵活 2.染菌、退化的几率小 3.可获得高的转化率
4.对发酵过程可实现优化控制 5.因经常灭菌会降低仪器使用寿命
缺点 1.因放罐、灭菌等原因，非生产时间长 2.经常灭菌会降低仪器寿命 3.前培养和种子的花费大
4.需较多的操作人员或较多的自动控制系统 1.操作不灵活 2.因操作条件不易改变，原料质量必须稳定 3.若采用连续灭菌，加上控制系统和自动化 设备，投资较大 4.必须不断地排除一些非溶性的固型物 5.易染菌，菌种易退化
迅速生长，而目的代谢产物的产量会减少。而当营养物严重缺乏 时，菌体生长受抑制，代谢产物的产量也会减小 )
• 营养缺陷型菌株的培养
二、如何进行流加发酵操作？ 1. 流加发酵类型 2. 采用流加发酵应该解决的关键问题？ 3.流加发酵过程中某些重要参数的确定 4.合适的流加发酵类型的确定 5. 流加方式的应用
指数速率流加的速率F的表达式为:
F
1
(
(S0 S) Yx / s
ms ) X FVF e(ttF )
其中tF为开始指数速率流加的时间， t≥tF，XF和VF分别为tF时刻的菌体浓度和 发酵液体积
d (VX
细胞平衡： dt
)
Vrx
碳平衡：
d (VS) dt
Vrs
FS0
产物平衡：dVP
dt
Vrp
体积平衡：dV F dt
恒流速流加过程中的流量F的确定： (a)预试验中所得出的流加时刻菌体对
所流加基质的消耗速率 (b)发酵液中残留基质浓度 (c)流加后需要控制的发酵液中的基质
浓度
(2) 指数速率流加
在采用流加发酵技术之前要考虑的两个 问题
一、何时采用流加发酵方式？
二、如何进行底物的流加？
一、何时采用流加发酵方式？
• 所用底物在高浓度时对菌体生长有抑制 作用
• 高菌体浓度培养即高密度培养系统
• 非生长耦联性次级代谢产物(如产物的合 成需要某些营养物质或前体)
• 利用营养突变体的系统(过量加入营养物只能使菌体