在进行新生物制品产品开发时，首先要做的一项工作是建立理化对照品及活性标准品。
理化对照品主要用于产品肽图、等电点、相对分子质量、纯度等理化性质的检测；活性参考品主要用于产品生物学活性的检测［1］。
进行理化对照品质量标准及质量方法的研究既便于检测和跟踪产品质量的一致性和稳定性，也是产品进一步走向临床和市场的必然要求，《中国药典》三部（2015版）也对其提出了明确规定［2-3］。
重组人血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抑制剂是有VEGF阻断作用的重组蛋白，由2种不同的人VEGF受体VEGFR1和VEGFR2的细胞外区域，融合到人免疫球蛋白IgG1的Fc部分组成，是一种二聚体糖蛋白，其蛋白质相对重组人血管内皮生长因子抑制剂理化对照品质控方法及质量标准的建立毕华，陶磊，韩春梅，秦玺，范文红，杨靖清，丁有学，饶春明中国食品药品检定研究院重组药物室，北京100050摘要：目的建立重组人血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抑制剂理化对照品质控方法及质量标准。
方法利用HEK293细胞增殖抑制法测定重组人VEGF抑制剂理化对照品生物学活性；紫外分光光度法测定蛋白含量；质谱法进行相对分子质量测定、液质肽图及糖基化位点分析、二硫键分析、N-寡糖糖型及比例分析；SDS-PAGE及SEC-HPLC法分析纯度；等点聚焦法进行电荷异质性分析；Edman降解法进行N-末端氨基酸序列分析。
结果重组人VEGF抑制剂理化对照品各项检定指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部（2015版）相关要求。
结论建立的质控方法和质量标准符合理化对照品的相关规定，具有保证该理化对照品结构正确、质量可控的特点。
检定合格的理化对照品可用于该类产品的常规检定。
关键词：血管内皮生长因子抑制剂；理化对照品；质量控制中图分类号：R979.1+9R392-33文献标识码：A文章编号：1004-5503（2017）08-0833-05Establishment of methods and standard for quality control ofphysicochemical reference substance for recombinanthuman vascular endothelial growth factor inhibitorBI Hua,TAO Lei,HAN Chun-mei,QIN Xi,FAN Wen-hong,YANG Jing-qing,DING You-xue,RAO Chun-mingNational Institutes for Food and Drug Control,Beijing100050,ChinaCorresponding author:RAO Chun-ming,E-mail:raocm@；DING You-xue,E-mail:dingyouxue@Abstract：Objective To establish the methods and standard for quality control of the physicochemical reference sub-stance for recombinant human vascular endothelial growth factor inhibitor（rhVEGF inhibitor）.Methods The biological activity of reference substance for rhVEGF inhibitor was determined by HEK293cell proliferation inhibition test,while the protein content by ultraviolet（UV）spectrophotometry.The relative molecular mass,liquid peptide map,glycosylation site, disulfide bond,type and proportion of N-oligosaccharide of the reference substance were analyzed by mass spectrometry, while the purity by SDS-PAGE and SEC-HPLC,the charge heterogeneity by isoelectric focusing,and the N-terminal amino acid sequence by Edman degradation method.Results All the indexes of rhVEGF inhibitor met the requirements in Guideline for Quality Control of Recombinant DNA Products for Human Use and Chinese Pharmacopoeia（Volume III, 2015edition）.Conclusion The established methods and standard met the requirements for the relevant physical and chemical reference substances,which may assure that the structure of the reference substance is correct and the quality is controllable.The qualified reference substance may be used for the routine quality control of products of the same kind.Key words：Vascular endothelial growth factor（VEGF）inhibitor;Physicochemical reference substance;Quality control·治疗性制剂·通讯作者：饶春明，E-mail：raocm@；丁有学，E-mail：dingyouxue@DOI:10.13200/ki.cjb.001845分子质量为96900。
其中含有约15%的糖基化，总相对分子质量为115000，结构较复杂。
在成年啮齿类和灵长类动物中，VEGF抑制剂可预防脉络膜新血管形成，减少视网膜血管渗漏和炎症［4-5］，具有广阔的应用前景。
本文以申报临床阶段的重组人VEGF抑制剂理化对照品为例，根据《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部（2015版）的要求，结合该产品的特点，进行了质量标准建立的相关研究［6-8］，现将结果报道如下。
1材料与方法1.1对照品及参考品重组人VEGF抑制剂理化对照品、活性参考品、rhVEGF121由申报单位提供。
1.2细胞HEK293细胞由申报单位提供。
1.3主要试剂及仪器荧光素酶受体基因检测系统购自美国Promega公司；糖苷酶PNGaseF和Rapid PNGase F酶购自美国NEB公司；DMEM培养基、FBS、非必需氨基酸（non-essential amino acid，NEAA）、遗传霉素（geneticin，G418）、OptiMEM培养基均购自美国Gibco公司；潮霉素B（hygromycin B）购自德国Roche公司；GlycoWorks RapiFluor-MS N-糖分析试剂盒（176003606）、蛋白酶解表面活性剂Rapi Gest SF、ACQUITY H Class超高效液相色谱系统、Xevo G2QTOF质谱仪及Unify操作软件购自美国Waters 公司；乙腈购自美国Fisher Scientific公司；Trypsin 购自美国Sigma公司；SpectraMax M5多功能酶标仪及SOFTMAX分析软件购自美国Molecular Device 公司；PPSQ21A蛋白质测序仪购自日本岛津公司。
1.4生物学活性测定用含10%FBS、1%双抗溶液、1%NEAA、0.5%G418和0.1%潮霉素B的DMEM培养基培养HEK293细胞。
取对数生长期细胞，胰酶消化后，用OptiMEM+0.1%FBS培养基中和，560×g 离心5min，弃上清，用OptiMEM+0.1%FBS培养基重悬，调整细胞浓度为1.25×105个／ml，接种至96孔板中，80μl／孔，置培养箱培养15～20h。
用OptiMEM+0.1%FBS培养基将理化对照品和活性参考品预稀释至5nmol／L，再于96孔板上进行倍比稀释，共8个浓度梯度，每个梯度设2个复孔。
将以上稀释好的对照品和活性参考品加入已接种HEK293细胞的培养板内，10μl／孔，再加入用Opti MEM+0.1%FBS培养基配制的浓度为200pmol／L 的rhVEGF121溶液10μl，得到rhVEGF121最终浓度为20pmol／L。
混合后置37℃，5%CO2条件下培养5～7h。
用荧光素酶受体基因检测系统进行检测，利用SOFT MAX软件分析数据，以VEGF抑制剂的浓度为横坐标，对应的平均RLU（相对光单位）值为纵坐标，选用的回归模型为四参数方程，绘制每个板的活性参考品和供试品剂量反应曲线。
根据各供试品的IC50，按下式计算其生物学活性。
供试品相对百分效价（%）=供试品IC50／活性参考品IC50×100%1.5蛋白含量测定用10mmol／L磷酸钠缓冲液，150mmol／L NaCl的缓冲液稀释供试品至0.25～1.0mg／ml，并使用缓冲液制备1份空白溶液，其稀释因子应与样品溶液的稀释因子一致。
在紫外分光光度计中测量其A280和A320值。
校正样品吸光度：A280，校正=A280-A320，确保A280校正值在0.282～1.207AU范围内。
样品浓度（mg／ml）=（A280，校正×DF）／EC式中DF为稀释因子，EC为消光系数（1.15ml／mg）。
1.6质谱相对分子质量测定参考文献［9-11］进行。
1.6.1样品的还原及切糖取1支样品，用变性溶液稀释至1mg／ml，取0.5ml，加入1mol／ml的DTT 溶液10μl，45℃孵育30min；用10k的超滤管将缓冲液置换为反应溶液，终体积0.5ml，取100μl，加入5μl糖苷酶PNGaseF，37℃孵育3h；瞬时离心，取上清。