14
Relative kinase activity
12 10 8
6
4 2 0 0 5 10 20 30 60 90 120
Time (min)
Effect of individual MAPK pathways on PRAK activity in intact cells
Control MKK7(D) MKK1(E)
几种MAPK通路抑制剂的化学结构示意图:
O NH2 OCH3 N H N OH O
N
F
PD98059
OCH3 O CH=CH OH
SB202190
N
H N S N CH3 O
O
CH=CH
OH OCH3
F
Curcumin
SB203580
Effects of SB203580 and PD98059 on endogenous PRAK activity
25 36 32 35 38
Construction of p38 loop-12 to ERK like structure
p38 p38(E) p38(6+) p38(6+E) p38(VAP) p38(DL) p38(VAPD6+LE) ERK2
...DFGLARHTDDE------MTGYVATRWYRAPE... ...DFGLARHTDDE------MTEYVATRWYRAPE... ...DFGLARHTDDEHDHTGFMTGYVATRWYRAPE... ...DFGLARHTDDEHDHTGFMTEYVATRWYRAPE... ...DFGLARVADPE------MTGYVATRWYRAPE... ...DFGLARHTDDD------LTGYVATRWYRAPE... ...DFGLARVADPDHDHTGFLTEYVATRWYRAPE... ...DFGLARVADPDHDHTGFLTEYVATRWYRAPE...
信号通路研究的技术方法
一、蛋白激酶磷酸化及其活性测定 二、蛋白磷酸化位点分析及其功能鉴定 三、DNA重组技术的应用 四、病毒技术对于揭示细胞信号通路的作用 五、细胞信号分子特异性抑制剂的应用 六、细胞信号分子的荧光标记 七、细胞信号分子的三维结构分析 八、蛋白质与蛋白质相互作用的研究 九、报告基因技术 十、蛋白质与核酸相互作用技术
MAPK Dural Phosphorylation Sites L-12 Length * * DFGLARHTDD-------------EMTGYVATRWYRAPE 25 DFGLARQADE-------------EMTGYVATRWYRAPE 25 DFGLARQADS-------------EMTGYVVTRWYRAPE 25 DFGLARHADA-------------EMTGYVVTRWYRAPE 25 DFGLARTAGTS-----------FMMTPYVVTRYYRAPE 27 DFGLARTACTN-----------FMMTPYVVTRYYRAPE 27 DFGLARTAGTS-----------FMMTPYVVTRYYRAPE 27 DFGLARIADPEHDH-------TGFLTEYVATRWYRAPE 31 DFGLARVADPDHDH-------TGFLTEYVATRWYRAPE 31 DFGMARGLCTSPAEH------QYFMTEYVATRWYRAPE 32
Chromatograph y
+
+
+
Electrophoresis pH1.9
Electrophoresis pH1.9
Electrophoresis pH1.9
T182 is the regulatory phosphorylation site of PRAK
A
p38-PRAK(182A)
B
hp38 hP38 hp38 hp38 hJNK1 hJNK2 hJNK3 hERK1 hERK2 hBMK1
YHOG1 DFGLARIQDP-------------QMTGYVSTRWYRAPE YSMK1 DFGLARGIHAGFFKCHS--TVQPHITNYVATRWYRAPE YMPK1 DFGLARGYSENPVEN------SQFLTEYVATRWYRAPE YKSS1 DFGLARCLASSSDSRET---LVGFMTEYVATRWYRAPE YFUS3 DFGLARIIDESAADNSEPTGQQSGMTEYVATRWYRAPE domain VII VIII
p38
LPS、UV刺激心肌细胞共聚焦显微镜大体扫描
LPS
UV
Control
七、细胞信号分子的三维结构分析
蛋白质三维结构分析对于揭示信号分子的功能的作用
八、蛋白质与蛋白质相互作用的研究
蛋白激酶结构域
PH TH SH3 SH2 Kinase Btk
SH3
SH2
Kinase
Src
1.蛋白质结合实验
+ - + - + - + - + + + - + p38 HSP27 Fold of Activation
+
p38-PRAK(182D)
20
15 10 5 0
+
p38-PRAK(wt)
+
Electrophoresis pH 8.9
三、DNA重组技术的应用
活性诱变体 无活性诱变体 结构与功能的研究
15 Relative luciferase activity
10
5
0 LPS LPS+FHPI Control EGF
Induction of c-Jun through MEF2C phosphorylation by p38
十、蛋白质与核酸相互作用技术
研究细胞内蛋白质尤其是转录因子与特定核酸序列的相互作用。
-80kDa -47kDa -39kDa
P38 MAP Kinase Pathway
二、蛋白磷酸化位点分析及其功能鉴定
Phosphopeptide map of HSP27 hosphorylated by PRAK in vitro
Chromatography PRAK Chromatography MAPKAPK2 MIX
十一、对细胞内信号分子的干预技术 十二、信号分子基因表达检测技术
一、蛋白激酶磷酸化及其活性测定
蛋白激酶磷酸化的检测


裂解培养的细胞获得裂解上清
以免疫共沉淀法获得蛋白激酶
SDS-PAGE
再加入蛋白激酶磷酸化特异性抗体
以Phospho Ab-HRP Western 化学发光检 测试剂盒测定蛋白激酶的磷酸化程度。
p38
HSP27
TNF
-
+
-
+
-
+
-
-
-
+ + -
+ +
- -
- -
Arsenite PMA SB203580 PD98059 -
- + - -
- - - - + + + - - + _ +
+ - +
六、细胞信号分子的荧光标记
LPS
EGF
Control
p38
p38
p38
pR primer
PCR primer
The relationship between the members of MAPK family
JNK2 JNK3 JNK1 p38 p38 p38 p38 ERK1 ERK2 ERK5
Loop-12(T-Loop) sequence of MAP kinases
第 一 步 附着
第二步 激活
第三步 紧密粘附
第四步 渗出
：趋化因子受体
：Ig家族成员 ：白细胞激活物 ：选择素配体
EC EC
：选择素 ：白细胞整合素 ：PECAM
白细胞的渗出过程
5. 噬 菌 体 展 示 技 术
九、报告基因技术
研究细胞信号转导通路通过转录因子对基因启 动子转录活性的影响。
p38 is involved in the enhancement of TNF- promoter transactivity
EMSA
十一、对细胞内信号分子的干预技术
研究细胞内蛋白质尤其是转录因子与特定核酸序列的相互作用。
反义核酸技术的应用
RNAi
RNAi
Figure 1. Effects of mex-3 RNA interference on levels of the endogenous mRNA. Nomarski DIC micrographs show in situ hybridization of 4-cell stage embryos. (A) Negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization probe. (B) Embryo from uninjected parent showing normal pattern of endogenous mex-3 RNA (purple staining). (C) Embryo from parent injected with purified mex-3 antisense RNA. These embryos (and the parent animals) retain mex-3 mRNA, although levels may be somewhat less than wild type. (D) Late 4-cell stage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3 ; no mex-3 RNA is detected. (Templates used for interfering RNA and in situ probes were largely nonoverlapping.)