一、冷冻干燥技术原理冷冻干燥即通常所说的冻干，是将含有大量水分的生物活性物质先行降温冻结成固体，再在真空和适当加温条件下使固体水分子直接升华成水汽抽出，最后使生物活性物质形成疏松、多孔样固状物。

冷冻于燥技术的特点是：整个冻干过程在低温真空条件下进行，能有效地保护热敏性物质的生物活性，如酶、微生物、激素等经冻干后生物活性仍能得到保留；能有效地降低氧分子对酶、微生物等的作用，保持物质原来的性状；干燥物呈海绵状结构，体积几乎不变，加水后迅速溶解，并恢复原来状态；干燥能排除95%以上的水分，使干燥后的产品能长期保存而不致变质。

二、冷冻干燥技术方法（一）冻干设备与装置物质的冻干在冷冻真空干燥系统中进行。

冷冻真空干燥系统由致冷系统、真空系统、加热系统和控制系统四个部分组成。

1.致冷系统由冷冻机、冻干箱和冷凝器内部的管道组成。

其功用是对冻干箱和冷凝器进行致冷，以产生和维持冻干过程中的低温条件。

2.真空系统由真空泵、冻干箱、冷凝器及真空管道和阀门组成。

真空泵为该系统重要的动力部件，必须具有高度的密封性能，使制品达到良好的升华效果。

3.加热系统常利用电加热装置。

加热系统可使冻干箱加热，使物质中的水分不断升华而干燥。

4.控制系统由各种控制开关、指示和记录仪表、自动控制元件等组成。

其功用是对冻干设备进行手动或自动控制，使其正常运行，保证冻干制品的质量。

（二）冻干程序1.测量共熔点生物制品在冻干前多配成溶液或混悬液，溶液随温度降低而发生凝固冻结，达到全部凝固冻结的温度称为凝固点或称共晶点。

不同物质的凝固点不同。

实质上物质的凝固点也就是该物质的熔化点，故又称该温度为共熔点，准备冻干的产品在升华前，必须达到共熔点以下的温度，否则则严重影响产品质量。

不同生物制品的共熔点不同，生物制品的共熔点依其组成成分不同而异，必须测定每种生物制品的共熔点才有可能按此共熔点进行冻干。

测定共熔点的原理是根据导电溶液的电阻与温度相关，当温度降低时电阻加大，当降到共熔点时电阻突然增大，此时的温度即为该溶液物质的共熔点。

正规测定法是将一对白金丝电极插入液态制品中，并插入一支热电阻温度计，并将电极、温度计、仪表与记录仪连接，然后将溶液物质冷冻至一40℃以下低温，直到电阻无穷大，随后缓慢升温至电阻突然降低的温度即为该溶液物质的共熔点。

10%蔗糖溶液-2640%蔗糖溶液-3310%葡萄糖溶液-272%明胶、10%葡萄糖溶液-322%明胶、10%蔗糖溶液-1910%明胶、10%葡萄糖、0.85%氯化钠溶液-36脱脂牛乳-26马血清-35有冻干箱内预冻和冻干箱外预冻两种。

将溶液物质分装于小瓶、安瓿等小容器，置冻干箱的分层搁板上后密闭，在一40℃以下进行预冻，称为箱内预冻；如分装后置一40℃以下低温冰箱冻结后再移入冻干箱内进行冻干的称箱外预冻。

此外，如大装量的血浆制剂等则在箱外采用旋转冻结法预冻后再移入冻干箱内冻干。

预冻对冻干制品的质量至关重要。

影响预冻效果的因素有以下几个方面：（1）溶液物质的组分与浓度生物制品通常由水、生物活性物质（微生物、酶、蛋白质等）和保护剂（高分子物质、低分子物质等）组成，其中水以外的物质应含有一定比例才能保持冻干后的干物质具有一定的理化学性状，通常在4%~25%。

（2）装量物质在冻干时，容器的表面积与物质厚度比是一定的，亦即冻干与装量有关。

表面积大，厚度小有利于水分子升华，冻干容易而质量理想。

通常装量为容器容量的1/5~1/4，厚度不超过10mm。

（3）预冻速度溶液物质在冻结过程中由于机械效应和溶质效应而对细胞的活性有一定破坏作用，因此，每种物质都有不同的最低预冻温度、最短预冻时间和最佳预冻速度。

此三项数值可根据不同物质的共熔点、冻干机性能通过实验获得。

生物制品一般预冻时间为3~4h即可开始升华。

3.干燥制品干燥过程分两个阶段。

（1）升华干燥阶段在共熔点温度将冻结物质中的水分除去的过程称为升华。

冻结物质的共熔点温度亦即其升华温度，因此，必须对冻结物质加热，但温度不能超过其共熔点温度。

而低于共熔点温度过多，则升华速率降低，升华时间延长。

升华的进行取决于制品升华表面与冷凝器冷霜表面之间水蒸气的压力差，冻干箱内的压强一般为10~30Pa时，冻结物质容易获得热量，升华速度增加，压强超过30Pa时，产品吸收热量减少，升华速度减慢，发生融化。

升华干燥时间的长短与制品的共熔点、装量厚度、供热量等因素相关，经升华可除去90%以上的水分。

（2）解析干燥阶段使与物质结合的水分子通过加热方式除去的过程称为解析干燥。

通常在加热下迅速使物质温度上升到25~30℃，冻干箱内的压强控制在15~30Pa下进行解析干燥。

解析干燥的时间与物质品种有关，耐热物质解析干燥时间短；与残水量要求有关，对残水量要求越低的产品，解析干燥时间越长；与冻干机组的性能有关。

4.冻干的后处理冻干程序结束后，冻干箱仍处于真空状态，放入无菌干燥空气或氮气后才能打开箱门，取出制品。

干燥制品一旦暴露在空气中，即迅速吸收空气中的水分而潮解，并增高制品的含水量，或因氧气侵人而引起不可逆的氧化作用。

因此，必须迅速加塞和压盖。

干燥制品的加塞有箱内加塞法和箱外加塞法两种。

（1）箱内加塞法是根本防止干燥制品受空气中水分和氧气影响的方法。

采用有特殊装置的冻干箱和特制的瓶与塞相配合，冻干箱配有液压或气压压塞的动力装置；具有四脚的丁醛胶塞安置在冻干瓶口上，在真空或放入惰性气体下进行自动压塞。

箱内加塞须注意：①由于冻干瓶口上有四脚胶塞，从而增加了水气溢出阻力，因此，需相应调整冻干曲线，加热要适当减慢，时间要适当延长；②冻干箱内各板层的冻干瓶要安排均匀，缺少部分要用同样的带塞空瓶补足，以保证压力均等；③压塞力不易过大，由于箱内板层是串联的，即一层的压力即为全箱的压塞总力，每一层的力就是每一瓶所需的力乘以该层上放置的瓶数。

例如：每瓶压塞需力为5kg，每一板层放置1000瓶，则压塞的力为：5kg×1000=5000kg。

（2）箱外压塞法在冻干结束后，即放入无菌干燥空气或氮气，开启冻干箱门，迅速加塞，抽真空，封蜡，或加塞、压盖铝帽再抽空。

如制品数量多而封口时间过长时，则可分批出箱或转移到另一干燥箱内后分批进行封口。

三、冻于保护剂冻干保护剂又称稳定剂或分散剂，是指在冻干过程中及其后使生物制品的活性物质免受破坏的一类物质。

（一）保护剂的组成与功能生物制品冻干保护剂通常由三类物质组成，并由此三类物质组合成适用于各种生物制品的各种类型的冻干保护剂。

1.低分子物质包括糖类和氨基酸类。

低分子物质可产生均匀的混悬液，使微生物保持稳定的存活状态及对水分子起缓解作用；并能使冻干生物制品仍含有一定量水分；还可促进高分子物质形成骨架，使冻于制品呈多孔的海绵状，从而增加溶解度。

2.高分子物质范围很广，种类甚多。

高分子物质在冻干生物制品中主要起骨架作用，防止低分子物质的碳化和氧化；保护活性物质不受加热的影响；使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，从而使溶解度增加。

3.抗氧化剂包括一些有机的和无机的物质。

抗氧化剂具有抑制冻干制品中的酶作用，从而促进、保持微生物等活性物质的稳定性。

（二）常用的冻干保护剂各类微生物适用的保护剂很多，不同国家的配制方法也不相同。

即使同一种制品使用的保护剂组成也不一样，例如：鸡新城疫弱毒疫苗，我国选用5%蔗糖脱脂乳为冻干保护剂，而日本则用5%乳糖、0.15%聚乙烯吡咯烷酮、1%马血清或0.4%蔗糖脱脂乳、0.2%聚乙烯吡咯烷酮作保护剂。

1.不同微生物适用的保护剂由于细菌、病毒、支原体、立克次氏体、酵母菌等生物学特性不同，其适用的冻干保护剂也不相同。

病原性细菌：适用的冻干保护剂有10%蔗糖，5%蔗糖脱脂乳，5%蔗糖，1.5%明胶，10%~20%脱脂乳，含1%谷氨酸钠的10%脱脂乳，5%牛血清白蛋白的蔗糖，灭活马血清等。

厌氧细菌：含0.1%谷氨酸钠的10%乳糖，10%脱脂乳，7.5%葡萄糖血清等。

病毒：常用下列物质的不同浓度或按不同的比例混合组成冻干保护剂。

这些物质有明胶、血清、谷氨酸钠、羊水、蛋白胨、蔗糖、乳糖、山梨醇、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮等。

支原体：50%马血清、1%牛血浆清蛋白、5%脱脂乳、7.5%葡萄糖加马血清等。

立克次氏体：常用10%脱脂乳。

酵母菌：可用马血清或含7.5%葡萄糖的马血清，含1%谷氨酸钠的10%脱脂乳。

2.几种兽用生物制品常用的保护剂（1）5%蔗糖（乳糖）脱脂乳保护剂用蔗糖（乳糖）5g，脱脂乳加至100ml，经充分溶解后100C蒸气间歇灭菌3次，每次30min，无菌检验后用于配苗。

用于羊痘冻干苗、鸭瘟冻干苗的保护剂。

（2）明胶蔗糖保护剂明胶2%~3%（重量/容积）、蔗糖5%（重量/容积）、硫脲1%~2%（重量/容积）。

先将12%~18%明胶液、30%蔗糖液和6%~12%硫脲液加热溶解，116C高压灭菌30~40min。

然后按组成比例进行配苗。

适用于猪肺疫弱毒冻干苗、猪丹毒弱毒冻干苗等细菌性疫苗保护剂。

（3）聚乙烯吡咯烷酮乳糖保护剂聚乙烯吡咯烷酮K30～35量1g，乳糖10g，蒸馏水加至100ml。

混合溶解后，120℃高压灭菌20min，经无菌检验后用于配苗。

（4）SPGA保护剂蔗糖76.62g，磷酸二氢钾0.52g，磷酸氢二钾1.64g，谷氨酸钠0.83g，牛血清白蛋白10g，无离子水加至1000ml，混合溶解后滤过除菌，经无菌检验后，用于鸡马立克氏病、火鸡疱疹病毒疫苗等的配苗。

2.冻干保护剂的作用机理（1）“水替代”假说冻干保护机理中的“水替代”假说认为，当冷冻干燥时，保护剂可与生物大分子的失水部位形成氢键，替代保持生物大分子空间结构和生物活性所必需的水分子，从而减轻了生物大分子冻干损伤。

1）保护剂对细菌细胞膜的保护水分子可通过氢键与细胞膜中磷脂的极性端相连，而且每个磷脂的极性端与其他磷脂分子的极性端被水分子隔开。

当磷脂干燥脱水时，极性端的密度增加，使处于液晶态的脂膜变成凝胶态，导致细胞膜结构发生相变，在室温下复水时，处于凝胶态的干燥质膜又经历了从凝胶态到液晶态的转变，由于膜经历了状态的转变，某些区域产生缺陷，使得膜渗漏，造成细胞死亡。

冻干保护剂特别是糖类保护剂分子上的羟基具有与膜磷脂上的磷酸集团连接形成氢键的能力，从而阻止和限制细胞膜因脱水而融合，降低相变温度（Tm），使脂膜不易向凝胶相转变而保持液晶相，增加膜的流动性。

Samuel等利用傅立叶变换红外光谱法（FTIR）测量了E.coli和B.thuringiensis的膜相变温度，干燥时不加糖，E.coli和B.thuringiensis的Tm 高于室温，干燥时加入海藻糖或蔗糖，可使干燥细胞的Tm降至室温之下。

天然保护剂中的血浆脂蛋白和卵黄脂蛋白具有与细胞膜脂蛋白类似的β折叠结构，两者具有良好的亲和性，从而对膜脂蛋白具有良好保护作用。