第17卷 第9期医学研究生学报Vol.17 No.9 2004年9月Journal of Medical Postgraduates Sep.2004#论 著#同种异体骨移植后骨愈合的实验研究周光新1, 吴苏稼1, 施 鑫1, 赵建宁1, 王与荣2, 马 捷3(南京大学医学院临床学院南京军区南京总医院1.骨科;2.医务部;3.病理科,江苏南京210002)摘要: 目的:通过有关的动物实验来探讨有关异体骨移植骨愈合的规律,以达到加速异体骨移植骨愈合的目的。
方法:24只新西兰大白兔为实验动物,随机分为实验组和对照组。
实验组用梯度降温、深低温保存的股骨外侧髁植入,在接触的骨面置入骨形态发生蛋白(B MP)骨基质,以金属螺钉固定;对照组用取下的自体股骨外侧髁原位植入,用与实验组相同的内固定方法固定;术后4、8和12周行大体标本观察,并行苏木精-伊红(H -E)染色及B MP 免疫组化染色,观察异体骨愈合的情况。
结果:深低温保存的同种异体骨移植愈合与自体骨相似。
BMP 染色在新生骨及其周围类基质表达阳性。
其愈合是从宿主骨向移植骨,从周围向中央,从哈佛管向其四周逐渐进行爬行替代的过程。
结论:同种异体骨移植愈合过程主要通过骨传导实现成骨,骨诱导亦发挥积极作用。
使用BMP 、合适的内固定、大小适合的移植物,可以使异体骨愈合的过程与自体骨相似。
关键词: 大段骨移植; 骨愈合; 同种异体骨中图分类号: R687.34 文献标识码: A 文章编号: 1008-8199(2004)09-0788-04*An experimental study to accelerate the healing of massive bone allograftsZHOU Guang -xin 1,WU Su -jia 1,SHI Xin 1,ZHAO Jian -ning 1,WANG Yu -rong 2,MA Jie 3(1.Departrnent o f Ortho paedics,2.Department o f the Medical Affairs,3.Department o f Patholo gy ,Clinical School o f Medical College o f Nanjing University /Nanjing General Hos pital o f Nanjing Command ,Nanjing 210002,Jiangsu ,China)Abstract: Objective:To investigate the mechanism and characteristics of massive bone allografts. Meth -ods:Twenty -four New Zealand rabbits were randomly divided into experimental and control groups.In the ex -perimental group,the bone defect was filled with a segment of osteoarticular allograft which was pretreated with gradient cooling and hypothermic freezer preservation,fixed with B MP and bolt needle.As for the control group,the osteoarticular autograft were inserted,and the bolt needle was applied,the follow -up times were four,eight,and twelve weeks.B one repair progress were compared by gross specimen,hemaloxylin and eosin stain as well as im munohistochemical staining of B MP in the two groups at 4、8、12weeks after transplanta -tion. Results:The cryopreserved allograft was able to produce bone induction with B MP,suitable internal fixation,and proper size,the speed of the union is similar to that of autografts.Ne w bone (osteoblasts and os -teoid)was positive against B MP.The processes of the creep -substitution was from united end to the allogenic bone,from periphery to the center of the allografts and from Harversian canals to its periphery. Conclusion:The creep -substitution process depends on osteoconduction,but osteoinduction plays an important role in the healing of bone allografts.With B MP on the bone surface,suitable internal fixation and proper size of the allo -graft,the bone -healing processes of massive allografts is similar to that of the autografts.Key words: Massive bone transplantation; Bone -healing; Allogeneic bone#788#收稿日期: 2003-07-23; 修订日期: 2004-01-29作者简介: 周光新(1978-),男,江苏建湖人,医师,医学硕士,从事骨科专业。
0引言骨与软骨恶性肿瘤的治疗以往的方法是单一的,即行截肢,希望能保住患者的生命,20世纪80年代后随着新辅助化疗的应用,磁共振成像(MRI)、数字式减法血管描记法(DSA)等新的影像诊断方法的出现,外科重建技术的发展,综合保肢治疗已成为四肢骨肿瘤治疗的主流和发展方向。
目前,在临床上保存肢体的方法主要有:¹自体移植,但该方法可以利用的骨量有限,而且不能进行关节重建;º利用金属移植物,但对年轻的肿瘤患者可能需要2次以上的关节置换和对正处于生长发育期的患儿不适用,而且费用昂贵;»利用同种异体骨与软骨移植,可以克服上述两种方法的缺点,同种异体骨不仅提供了强度、形态及大小合适的支持物,还提供了可愈合的肌肉、韧带及关节附着面。
如与宿主骨出现骨性愈合又无并发症出现,它将符合生物力学要求,并可终生使用,目前已成为保肢治疗的一种主要方法。
从有关的研究资料显示,加速异体骨的愈合主要是从下列几方面进行:骨源的采集和保存、手术技术、用一些促进骨生长和诱导成骨的生物制剂等。
为此,我们进行有关的动物实验来探讨促进异体骨移植骨愈合的有关规律,希望今后能提高和加速临床上异体骨移植后的骨愈合。
1材料与方法1.1实验动物新西兰大白兔(体重约3kg左右,雌雄不限),由南京军区动物实验中心提供。
1.2同种异体骨制备无菌状态下截取兔股骨外侧包括关节软骨及约占股骨全长20%的密质骨,去除软组织,刮除骨髓腔内骨髓,盐水反复冲洗干净,浸泡于庆大霉素盐水中,用双层血浆袋保存。
1.3骨组织的冷冻前保护和冷冻保存将获取的骨组织,用计算机控制的温度速率仪(美国MVE公司出品)按2e/min的降温速率将骨与软骨组织的环境温度降至-80e,再置入深低温冰箱(美国Dupont Suva公司出品)中保存。
1.4实验分组及手术方法1.4.1实验分组将实验动物随机分为对照组和实验组。
实验组共12只,分为4、8和12周组,每组4只;对照组12只,分4、8和12周组,每组亦4只。
上述4~12周为处死动物时间。
1.4.2手术方法以质量浓度为0.5%的氯胺酮和氟哌利多混合麻醉剂(30mg/kg)肌内注射麻醉,经常规消毒,手术显露兔下肢股骨,切除股骨外侧髁,植入同种异体骨,粗细尽量与原股骨匹配,在接触的骨面置入由上海骁博科技公司提供的骨形态发生蛋白(B MP)骨基质,以金属螺钉(直径3mm,齿距1.75 m m)固定。
对照组将取下的股骨外侧髁髓腔冲洗干净后原位植入,用与实验组相同的内固定方法固定。
1.4.3术后处理每只兔分笼,用南京军区实验动物中心提供的面状兔饲料喂养。
若动物意外死亡,则补齐实验动物数,分别于4、8、12周耳缘静脉注入空气处死动物。
1.5观察指标1.5.1大体标本将取下的标本去除软组织后,在新鲜状态下观察骨痂分布、上下结合部愈合情况。
1.5.2组织学观察¹苏木精-伊红(H-E)染色:将取下的标本去除软组织后,依地酸(EDTA)脱钙、石蜡切片,厚度4L m。
观察宿主骨-异体骨结合部及骨段内的组织学变化。
ºB MP免疫组化染色:4L m 石蜡切片经烘烤及脱蜡、脱水后,用0.1mol/L的PBS液(pH=7.4)漂洗3次,抗原修复液I修复。
每张切片加50L l正常山羊血清封闭液,置于4e下40 min。
甩去多余液体后,每张切片加50L l的B MP单克隆抗体(天津市灏洋生物制品有限公司产品),4e 过夜。
用0.1mol/L的PBS液(pH=7.4)漂洗3次,每张切片加50L l生物素标志的二抗,室温下孵育10min。
用0.1mol/L的PBS液(pH=7.4)漂洗3次后,滴加SAB C试剂,室温下孵育40min,用0.1mol/ L的PBS液(pH=7.4)漂洗3次,DAB显色液显色5 min后,PBS洗涤。
苏木精对比染色,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。
2结果2.1大体标本¹第4周:移植骨段周围已有骨痂从宿主骨向移植骨端爬行,骨折线明显,对照组上下结合部已连接,实验组未连接。
º第8周:实验组与对照组移植骨段周围有较多量骨痂生长,两者结合处较紧密连接,对照组的骨折线已较模糊。