Semi-dry transfer system
4.2.5
斑 点 杂 交
Allele-specific oligonucleotide (ASO) dot-blot hybridization can identify individuals with the sickle cell mutation. The schematic dot-blot at top shows the result of probing with an ASO specific for the normal -globin allele (A-ASO). The results are positive (filled circle) for normal individuals and for heterozygotes but negative for sickle cell homozygotes (dashed, unfilled circle). The dot-blot at the bottom shows the result of probing with an ASO specific for the sickle cell -globin allele (S-ASO), and in this case the results are positive for the sickle cell homozygotes and heterozygotes but negative for normal individuals. The A- and SASO were designed to be 19 nucleotides long in this case chosen from codons 3 to 9 of respectively the sense A and S globin gene sequences surrounding the sickle cell mutation site. The latter is a single nucleotide substitution (A→T) at codon 6 in the -globin gene, resulting in a GAG (Glu)→GTG (Val) substitution (see
• ＞40kb: Rf与分子大小无关 • 改变形状所需时间不同 • 交替改变的电场,线团→束状 • 胶孔中摩擦力不同
A-
B-
+B
+A
A-
-B
B+
+A
脉冲电场电泳示意图
A-
B-
+B
+A
垂直交变电场系统
A-
B-
+B
+A
箝位匀强电场系统
A+B
+A B-
场翻转系统 -
+
旋转胶系统
影响分辨率的因素
• 脉冲时间(0.1s-1000s): 长脉冲,大片段 • 电压: 场强↑,最大片段范围↑ • 电场夹角: 110–120 • 温度: 4℃
4.2.2 Southern杂交
• 质粒鉴定、基因位置、分子诊断
❖酶切和电泳法可以吗?
4.2.3 Northern杂交
• 样品, 电泳, 探针 ❖不宜碱变性 ❖勿低盐buffer洗膜 ❖胶中无EB
4.2.4 Western杂交
• 电泳, 印迹, 免疫学 • 主要步骤 ❖SDS-PAGE, blot ❖杂交(AP或HRP)
4.2 分子杂交技术
• Southern blot • Northern blot • Western blot
• dot blot • FISH • 菌落原位杂交
4.2.1 探针与探针标记
• 寡核苷酸片段 ❖ss or ds ❖足够长度 ❖不含互补区
1. 探针的标记
5’ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’ 3’ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5’
❖位置分布: 沉降速度、MW及离心时间 ❖样品BD = 该位置上的CsCl密度
2. 碱变性法
• pH12: 变性程度 • pH7: 复性速度 • 离心: 收集? • Sol I; II; III
T-DNA ocDNA
D-DNA L-DNA cccDNA
3. 沸水浴法
• 加酶破壁 • 沸水浴40 s • 离心 • Eth沉淀
基因操作常规技术 (ppt)
（优选）基因操作常规技术
4.1 核酸的分离与检测
• gDNA的分离 • 质粒DNA • RNA的分离
4.1.1 gDNA的提取
• 细胞破碎 • 去蛋白
• SDS法 • 酚抽提法
• DNA沉淀 • CTAB法
CTAB法
• 高盐: 溶解 • 低盐: 沉淀 ❖蛋白、多糖分离 ❖NaAc-70% alc
DNase I 5’ … G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’ 3’ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5’
DNA pol I Mg2+ 5dNTP 5ppp dA(-32P-dATP) 5’ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’ 3’ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5’
如何保持CS-DNA的完整性?
• 物理降解 • 内源DNase • ＞pH7
4.1.2 质粒DNA的分离纯化
• 拓扑学的差异 ❖gDNA大, 易解旋 ❖质粒小, ccc状态
1. CsCl密度梯度超离心
❖密度梯度 ❖沉降=扩散 ❖浮力密度差 ❖样品+EB
proteins
ocDNA L-DNA
cccDNA RNAs
荧光素: 罗丹明,FITC 合成法 荧光显微镜
地高辛系统标记
dUT物素标记
Biotin
生色底物 显色酶
GCTTGAGCAGTAACCTG 烷烃连接臂
Avidin
颜色产物
荧光素标记
Biotin GCTTGAGCAGTAACCTG
烷烃连接臂
荧光素 Avidin
缓冲液及其pH
• TBE: 缓冲力大 ❖长 : TAE﹥TBE ❖短: TAE分辨力低
如何防止pH和离子强度改变?
RNA的检测
• A260 • 变性胶 ❖28S→4.5 kb ❖18S→2.1 kb
PAGE
• 尿素 • buffer: 0.51TBE ❖同位素或荧光标记 ❖测序、多态性分析
脉冲场凝胶电泳
随机引物标记
5末端标记
5 HO 3 HO
T4-PNK
5p 3 HO
OH 3 OH 5
Mg2+ pppATP (-32P-dATP)
OH 3 p 5
2. 标记物及其检测
❖放射性标记 ❖非放射性
标记物及性质
标记方法 杂交体检测法
地高辛: DIG
RPL
酶标抗体-底物显色
生物素: Bio-16-dUTP NT,TL,PCR 酶标亲合素显色
凝胶电泳技术
• 分子筛; 电荷效应 • UV→EB→荧光
凝胶成像系统
Rf、分辨力的影响因素
• 大小, 构型 • gel浓度 • 电压、时间 • buffer
凝胶浓度 0.3 0.6 0.7 1.0 1.2 1.5 2.0
片段大小/kb 560 110 0.820 0.58 0.46 0.23 0.12
4.1.3 RNA的提取
• 原理 • 酚-异硫氰酸胍
防止RNA降解的措施
• DEPC处理 • RNasin • 专用无菌台 • 器皿、手套、口罩 • 低温操作
4.1.4 核酸质量检测
• 紫外光谱法 • 荧光分析法 • 凝胶电泳法 • 二苯胺显色
• [ssDNA]=33(A260A310) 稀释 • [dsDNA]=50(A260A310) 稀释 • [ssRNA]=40(A260A310) 稀释