酶工程实验指导实验一从植物材料中提取制备过氧化物酶一．实验目的学习从植物材料中制备过氧化物酶的方法，了解纯化酶的一些基本步骤。

比较不同植物材料过氧化物酶的含量与活性，掌握酶纯化的相关计算方法。

二．实验原理过氧化物酶（EC 1. 11. 1. 7）是一类以铁卟啉为辅基的氧化酶，在细胞代谢的氧化还原过程中起重要作用，在工业上也广泛被应用。

过氧化物酶可溶于水，溶解度约为5%（W/V），溶液呈棕红色，透明。

此酶可溶于0.58饱和度以下的硫酸铵溶液，而在0.62饱和度以上则不溶。

该酶能催化愈创木酚反应产生有色物质：以此可进行酶活性的测定。

许多植物如辣根、柑桔叶子、白萝卜等含有较多的过氧化物酶，在这些植物材料的溶出物中，加入不同浓度的硫酸铵进行分段盐析，对过氧化物酶进行粗提，然后用有机溶剂沉淀、结晶等方法可对该酶进行纯化，得出较纯的制品。

三．主要仪器与试剂仪器：组织捣碎机，冰箱，真空冷冻干燥机，离心机，紫外-可见分光光度计等。

试剂：愈创木酚，丙酮，过氧化氢，硫酸铵等。

四．实验步骤（尽量在冰浴中进行）鲜植物样品约70克，剪碎或捣烂，加少许水研磨成浆（可用捣碎机），转移到500ml的烧杯中，加水至约200ml，于冰箱中浸提约2小时（中间多次搅动）。

多层纱布挤压过滤后离心（4000rpm），10ml上清液用来测酶活力，其余上清液按226克/升加硫酸铵盐析，冰箱中静置1小时以上，离心(4000rpm)去沉淀。

上清液再按258克/升加硫酸铵盐析，冰箱中静置4小时以上。

离心收集沉淀，用水溶解至约10ml，用水透析去盐，离心去沉淀，取部分酶液稀释后测酶活。

其余酶液用作精制样品。

在搅动下沿着杯壁加入一倍体积预冷(-15℃)的丙酮于酶液中，混匀，静置10分钟，低温离心(8000rpm, 4℃) 去沉淀。

按上清液与丙酮之比为1比0.8再次加入预冷丙酮，静置10分钟后离心(8000rpm, 4℃) 收集沉淀，溶于少量水中，透析去丙酮。

测酶液的酶活，冷冻干燥酶液得较纯的酶制品。

五．过氧化物酶活力测定按下表于试管中加入试剂（ml）管号0.2M磷酸缓冲液pH6.00.05%愈创木酚酶液0.04%过氧化氢水1 2 3 11111111在37℃保温10分钟。

管1 作为对照在时间扫描470nm调好零点，混合管2与管3，即倒入比色杯中进行470nm的时间扫描，读取30或60秒时（直线部分）的O.D.值。

测定O.D.280和O.D.260，计算出蛋白质含量。

以O.D.470/mg蛋白质×分表示酶比活和以O.D.470/克鲜重×分表示酶活性。

注意酶液一定要稀释到合适的浓度才能准确测定酶活。

测定前要摸索出较好的酶液稀释度。

计算酶活时要特别注意稀释倍数的计算。

六．思考题：1. 纯化前后酶比活的变化说明什么？2．纯化前后酶活性（O.D.470/克鲜重×分）的变化又说明什么？实验二溶菌酶制剂的制备及其活力测定一．实验目的通过实践学习制备溶菌酶制剂的方法，了解酶制剂制备中常用的技术和方法的多样性。

掌握溶菌酶活力测定的基本原理和方法。

二．实验原理溶菌酶用途广泛。

鸡蛋清中存在有多种蛋白质，溶菌酶为其中含量较丰富的蛋白之一。

在接近中性条件下，溶菌酶容易被阳离子交换树脂吸附从而可与多种蛋白分离。

经过盐析和自结晶可进一步纯化溶菌酶。

溶菌酶能水解和破坏细胞壁，使细菌溶解，利用单位时间内菌体的溶解速度可以测定溶菌酶的活力。

三．主要仪器、材料与试剂仪器：研钵，布氏漏斗，冰箱，真空冷冻干燥机，离心机，搅拌机，水浴锅，紫外-可见分光光度计等。

材料与试剂：鸡蛋要蛋清，溶壁微球菌冻干粉，“724”树脂，硫酸铵，配制磷酸缓冲液的试剂，盐酸，NaOH，EDTA等。

四．操作步骤1. 树脂处理市售“724”树脂用水漂洗去掉细微杂质，用1mol/L NaOH浸泡3小时以上并间歇搅拌，去碱液，用水洗至pH7.5左右。

用1mol/L盐酸浸泡3小时以上并间歇搅拌，去酸液，用水洗至pH5.5左右。

水浸泡12小时以上pH不低于5.0时可去掉水，用2 mol/L NaOH快速浸泡搅拌即去掉碱液，调树脂pH至约6.5（泡树脂的水），若pH高于6.5，则需用盐酸洗树脂至pH6.5附近。

用pH6.5、0.15 mol/L 磷酸缓冲液浸泡树脂过夜，如pH下降，则用碱液调回pH为6.5，冷藏备用。

2. 树脂吸附鸡蛋清预冷至0℃左右，取约50ml，记录确切体积置于烧杯中。

将树脂于布氏漏斗上用pH6.5、0.15 mol/L磷酸缓冲液淋洗一遍抽干，取12g在不断搅拌下加入冷的蛋清中，继续以搅拌器搅拌1h以上，4℃静置过夜。

3. 洗脱与盐析倾去上层蛋清，用水二、三次和用pH6.5、0.15 mol/L磷酸缓冲液洗涤树脂，将树脂置于布氏漏斗上继续用pH6.5、0.15 mol/L磷酸缓冲液淋洗，后抽干移入小烧杯中。

用6ml 10%硫酸铵浸泡树脂并轻搅10min，收集硫酸铵溶液，重复一次。

将树脂置于布氏漏斗上（收集瓶一定不能有水），用6ml 10%硫酸铵滴淋树脂，收集滤液与前面硫酸铵液合并，量体积。

抽干的树脂可再生重复使用。

按33%（W/V）在搅拌下慢慢加硫酸铵粉末于洗脱液中，待硫酸铵溶解后静置15min，以3500rpm离心10min，收集沉淀。

4. 去杂与结晶析出用0.8ml水溶解沉淀，对水进行透析（只能轻搅，不能快速搅动水）至无硫酸铵。

将透析液移至小烧杯中，用0.1mol/L NaOH调pH至8.0―8.5（精密试纸测试），如有沉淀，离心去除。

量酶液体积，按5%（W/V）在搅拌下慢慢加NaCl 固体（防止局部过浓），待盐溶解后用0.1mol/L NaOH慢调pH至9.5―10.0，室温下静置过夜。

至沉淀（结晶）出现稳定后置4℃保存。

离心收集沉淀，为溶菌酶。

真空干燥后称重，计算得率。

5. 酶活力测定与计算用含1mmol/L EDTA的pH6.2、0.1 mol/L磷酸缓冲液配制含量约为50μg/ml 的溶菌酶液。

将溶壁微球菌冻干粉与少许含1mmol/L EDTA的pH6.2、0.1 mol/L 磷酸缓冲液混合，在研钵中研磨（不需用力）1min充分乳化，用同样缓冲液稀释，使菌液在450nm处的吸光值在0.5附近，为底物。

酶液和底物置25℃水浴10min，准备好分光光度计的时间扫描（磷酸缓冲液为对照），摇匀吸取3ml底物置于比色杯中，放进比色槽，用移液枪加0.2ml酶液于底物中，即进行时间扫描120秒。

以在25℃、pH6.2下每分钟使吸光值下降0.001为一个活力单位计算酶活力，即：每1mg酶的活力单位数= 1分钟吸光值下降数÷0.001/测试酶量(mg)酶得率（mg/ml蛋清）= 酶重/蛋清体积酶活力回收率（活力单位/ml蛋清）= 酶重×活力单位数/蛋清体积五．思考题1. 计算酶活力回收率有什么意义？2. 要测定溶菌酶的纯度应怎样做？实验三模拟过氧化物酶的制备、固定与应用一．实验目的学习一种人工合成模拟过氧化物酶的方法，了解柱子型固定酶的原理以及感性认识酶分析法的一些应用。

二．实验原理过氧化物酶的辅基是血红素。

在体外将血红素与牛血清白蛋白结合制备成含血红素的蛋白质分子作为模拟过氧化物酶。

在确定血红素与牛血清白蛋白结合后，检测其的过氧化物酶活性。

然后将此人工模拟酶固定在载体琼脂糖凝胶（Sepharose 4B）上并装柱，应用于检测样品中痕量过氧化氢的含量，因为过氧化氢的测定不论是在临床生物化学还是在环境化学和食品工业中都具有重要意义。

血红素是一活性分子，而血清白蛋白具有极强吸附能力，所以两者能结合。

由于含有血红素，该结合物就具有过氧化物酶的特性。

琼脂糖凝胶在激活后能很好的吸附蛋白质分子从而把蛋白质分子（模拟过氧化物酶）固定。

过氧化物酶能极敏感的催化过氧化氢分解从而使邻苯二胺变成有色物质2，3-二氨基吩嗪，反应如下：产物2，3-二氨基吩嗪在428nm处有光吸收峰，所以能以此反应来测定过氧化物酶的活性和检测过氧化氢的含量。

三．主要仪器与试剂仪器：紫外-可见分光光度计，摇床，水浴锅，天平，布氏漏斗，恒流泵等。

试剂：氯化血红素、牛血清白蛋白，过氧化氢，邻苯二胺，氨水，环氧氯丙烷，Sepharose 4B，1，4-二氧六环等。

四．操作步骤1．以等摩尔数将牛血清白蛋白与氯化血红素结合称取3.216g 牛血清白蛋白于少量水中溶解，后加水至约30ml。

先用几滴氨水使0.0312g氯化血红素溶解，加少量水搅匀，然后在搅拌中缓慢滴至30℃的牛血清白蛋白溶液中，最后用水使混合液最终总体积为80ml。

其中所含氯化血红素和牛血清白蛋白的最终浓度均为0.6mmol/L。

在30℃水浴中20分钟（以上全班只做两份）。

该混合液经吸收光谱测定确认牛血清白蛋白与血红素结合后，稀释4倍，以稀NaOH或稀HCl调pH约为9.5。

每组取16ml备用。

2．载体Sepharose 4B的活化将适量的Sepharose 4B于烧结漏斗中（抽气过滤）抽干，称取8g（湿重），以100ml 1mol/L NaCl和100ml蒸馏水先后在漏斗上洗涤，抽干后移至小三角瓶内，加入6.5ml 2mol/L NaOH、1.5ml环氧氯丙烷、15ml 56% 1，4－二氧六环，于40℃的恒温摇床中振摇活化2h后取出，在烧结漏斗中以蒸馏水和0.2mol/L，pH9.5 Na2CO3-NaHCO3缓冲液洗涤、抽干。

3．模拟过氧化物酶与载体的连接将10ml牛血清白蛋白-氯化血红素复合物（其余6ml用作酶活力和偶联率的测定）与活化的载体Sepharose 4B混合，在40℃摇床上振荡偶联24h左右，在烧结漏斗中收集滤液，并用少许蒸馏水淋洗一并收集，量体积，用作未结合模拟酶的量的测定，算出偶联率。

将偶联复合物用0.2mol/L，pH9.5 Na2CO3-NaHCO3缓冲液浸泡后装柱。

用相同缓冲液平衡。

4．模拟酶固定前活力的测定及固定后的应用固定前酶活力的测定：将2ml 20mmol/L邻苯二胺与定量模拟酶（如可以是5、10、15μl等）混合后，再与1ml 20%过氧化氢混合，即用时间扫描测定反应0.5或1min时428nm处的吸光度，以O.D值/分.m g酶来表达酶的活力。

固定装柱后对过氧化氢检出值的测定：将柱子柱面上平衡液放至界面，把3ml20mmol/L邻苯二胺与含微量过氧化氢（如2μl）的水样品1ml混合，用恒流泵以0.5ml/min的流速使样品经过柱子（洗脱液用0.2mol/L，pH9.5 Na2CO3-NaHCO3缓冲液），收集有色过柱液3ml并测428nm的吸光值，以水代替过氧化氢与邻苯二胺混合过柱作为对照。

改变过氧化氢含量重复以上操作，测定出过氧化氢的最低检出值。

以过氧化氢含量与OD值的关系作出标准曲线，也可测定污水或雨水中过氧化氢的含量（注意相同条件才能比较）。