上海交通大学硕士学位论文GDNF和EGFP双基因共表达重组杆状病毒载体的构建及鉴定姓名：陈艳春申请学位级别：硕士专业：耳鼻咽喉科学指导教师：王士礼20090101GDNF和EGFP双基因共表达重组杆状病毒载体的构建及鉴定摘要目的构建胶质细胞源性神经营养因子和增强型绿色荧光蛋白双基因表达杆状病毒载体并检测其在体外的表达。
方法采用分子克隆技术，从pAA V－GDNF质粒酶切获得大鼠GDNF 目的基因，胶回收目的片段，连接目的基因与载体pFB－EGFP片段，通过测序明确目的基因成功克隆在载体中。
利用Bac－to－Bac杆状病毒表达系统制备穿梭杆粒Bacmid，用PCR方法鉴定Bacmid，脂质体cellfectin 转染sf9细胞获取杆状病毒，空斑实验测定病毒滴度，细胞免疫荧光法测定GDNF、EGFP蛋白的表达。
结果重组质粒BamHI和SalI双酶切后琼脂糖电泳可见640bp处出现特异性条带，证明pFB－GDNF－EGFP重组质粒构建成功，测序发现基因序列完全正确。
用M13引物鉴定Bacmid，产物经琼脂糖电泳见4000bp 片段，与预期结构相符；转染sf9细胞扩增后获得病毒滴度为3×1010pfu/ml, sf9中共表达GDNF和EGFP蛋白。
结论成功构建质粒pFB－GDNF-EGFP，包装杆状病毒，且获得高滴度的重组杆状病毒，且能共表达胶质细胞神经营养因子以及增强型绿色荧光蛋白。
为后续GDNF重组杆状病毒载体应用于内耳基因治疗打下基础。
关键词杆状病毒，胶质细胞源性神经营养因子，增强型绿色荧光蛋白，共表达，基因治疗Construction and identification of recombinant baculovirus vector co-expressing glial cell line-derived neurotrophic factor and enhanced green fluorescent proteinABSTRACT[Objective] To construct a novel recombinant baculovirus vectorco-expressing glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) and enhanced green fluorescent protein(EGFP).[Methods] Rat GDNF gene fragment from the plasmid pAAV－GDNF was cloned into pFB－EGFP. Restriction analysis and nucleotide sequencing were used to confirm the structure of pFB－GDNF－EGFP. The recombinant plasmid was introduced into E.coli DH10Bac which included a shuttle vector-Bacmid, the Bacmid was identified by PCR. The sf9 cells was transfected with Bac-GDNF-EGFP using cellfectin. The purified recombinant virus was detected by plaque assay. Sf9 cells was infected by Bac-GDNF-EGFP to co-express GDNF and EGFP gene, their expression product was measured by cell fluorescenece microscope.[Results] Identified by double digestion with restriction endonucleases BamHI/SalI, the GDNF fragment was successfully inserted into pFB－GDNF－EGFP. The purified recombinant virus had a high titer of 3×1010 pfu/ml. The stable coexpression of recombinant proteins were observed in sf9 cells.[Conclusion]The recombinant baculovirus carrying GDNF and EGFP was successfully constructed and the protein of EGFP and GDNF were coexpressed in sf 9 cells. This study provided a sound basis of further GDNF gene therapy study.[Key words]baculovirus, glial cell line-derived neurotrophic factor, enhanced green fluorescent protein, coexpression , gene therapy上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。
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（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日引言耳聋是影响人类生活质量最主要的问题之一，其中绝大多数是感音神经性耳聋[1]。
据统计，超过10％的成年人患有不同程度的感音神经性耳聋。
由于环境噪音的污染，抗生素的滥用以及人口老龄化等因素的影响，感音神经性耳聋发病率会进一步上升[2]。
感音神经性耳聋由于毛细胞、听神经、听觉传导经路或各级神经元受损害，至声音的感受与神经冲动传递障碍或皮层功能缺如。
感音神经性耳聋一向被认为是耳科的难治之症，目前尚缺乏确切有效的临床治疗手段。
虽然电子耳蜗给一部分病人带来福音，并不同程度地提高耳聋病人的听力及生活质量，但电子耳蜗植入有其适应症，同时耳蜗神经元会进一步变性最终导致电子耳蜗植入术的一部分病人重新走回无声的世界。
近年随着分子生物学的发展，感音神经性聋的发病机制在分子和细胞水平上得到了进一步的阐明[3]。
实验证明一些神经营养因子、抗氧化剂、一氧化氮产物抑制剂和谷氨酸（盐）受体拮抗剂[4-12]等对感音神经性耳聋有确切的作用，在治疗内耳疾病及防治耳毒性药物、噪声、感染等因素对内耳的破坏方面有着广泛的应用前景。
神经营养因子是一类对神经细胞增值、分化和存活所必须的蛋白质因子，对维持神经系统的正常功能有重要作用。
已有研究证实胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF）对听觉神经元起到明显的保护作用。
GDNF是于1993年Lin[13]等从大鼠胶质细胞B49培养上清中提纯到的一种新的神经营养因子，是一种具有神经营养和神经保护作用的神经营养因子，多种动物模型的研究证实GDNF能够促进多巴胺神经元，运动神经元的存活及损伤后神经突触的重建[14－16]。
1998年研究发现GNDF对噪音性听力损伤有保护作用[17]。
后来更多的研究发现，GDNF对噪声、耳毒性药物引起的听力和毛1细胞损失有明显的保护作用[18-20]。
此外，GDNF在螺旋神经节细胞的存活、兴奋以及促进螺旋神经节轴突的再生中有明显的效果[21]。
内耳有其独特的组织结构和内环境，由于有血迷路屏障的存在，许多药物不能到达靶细胞发挥生物学效用。
神经营养因子均为大分子蛋白质，较难透过血迷路屏障，为达到内耳的有效治疗浓度的全身应用剂量可引起不良反应，已有研究证实过量的GDNF的注入会带来副作用[22]，这成为阻碍其临床应用的主要原因。
近年来基因治疗技术的飞速发展给耳科工作者提供了一个潜在的治疗耳聋的新手段，为攻克这一顽症带来了新希望。
内耳的解剖特点使耳蜗拥有其他器官所没有的特性，为内耳基因治疗提供了理想的环境。
首先，耳蜗相对独立，病毒或非病毒载体携带的外源基因不易扩散到其他组织，从而最大限度的降低一些不必要的副作用。
耳蜗的内外淋巴系统使载体在内耳易于扩散并均匀分布。
并且我们已知道内外淋巴的容量，耳科工作者很容易控制基因治疗的浓度及给药的速度和方式，从而保证了这些因子对实验动物起有效的保护作用及治疗作用。
基因治疗是在基因水平上将目的基因用基因转移技术导入靶细胞，使其表达此目的基因，而获得持久功能从而达到治疗目的。
基因治疗的关键之一是如何选择合适的载体系统，将目的基因导入靶细胞，得到稳定、高效表达。
基因治疗的载体分为病毒载体和非病毒载体两类，非病毒载体包括脂质体、壳聚糖、阳离子多聚物等，病毒载体有腺病毒载体，腺相关病毒载体，单纯疱疹病毒，慢病毒，杆状病毒载体等。
由于病毒基因结构简单，分子背景比较清楚，易于改造和操作，感染效率高，有较高靶细胞特异性，故在以基因治疗为目的的载体系统中，病毒载体就格外令人关注。
腺病毒载体是一种线性双链DNA无胞膜病毒，由于其外源基因的容量大（36kb），表达效价高，可以感染非分裂和可分裂细胞，而作为基因转导载体用于耳聋的治疗。
但其感染容易引起机体的病毒反应和免疫反应，导致细胞溶解，限制了其应用[23]。
腺相关病毒载体是一种无胞膜的单链线状DNA 病毒，是一种缺损型病毒，它只有与辅助病毒如HSV共同感染时才能进行有效的复制和产生溶细胞性感染。
在辅助病毒不存在的情况下，腺相关病毒的DNA可以以双链DNA的形式整合入宿主的染色体，保持一种稳定的潜伏状态。
其易生长，2获得的滴度高，稳定性好，便于浓缩、纯化和灭活辅助病毒。
但其作为载体，外源基因的容量小（4.5kb），限制了其利用。