EBV LMP2A和BZLF1融合基因重组腺病毒表达载体的构建【摘要】目的构建EB病毒（EBV）潜伏膜蛋白2A(LMP2A)编码基因和即刻早期基因(BZLF1)融合基因的重组腺病毒表达载体。
方法逆转录聚合酶链反应分别获得LMP2A和BZLF1编码序列的cDNA，采用剪接式重叠延伸（SOE）技术将两段基因通过多肽接头(Gly4Ser)3 的DNA 序列进行连接，构建融合基因Z2A。
将融合基因Z2A定向亚克隆到pAdTrack CMV 质粒上，在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒pAdEasy1的同源重组，构建融合基因Z2A真核表达载体pAd Z2A。
经抗生素培养板筛选重组体，然后转染293细胞，获得复制缺陷型重组腺病毒vAd Z2A。
结果重组腺病毒载体经限制性核酸内切酶酶切，电泳后可观察到长31 kb和4.5 kb 两条DNA条带，测序鉴定结果表明序列正确；从感染重组腺病毒vAdZ2A的293细胞中检测到融合基因Z2A的表达。
结论本研究成功地构建了EBV LMP2A和BZLF1融合基因Z2A重组腺病毒表达载体，为进一步研究Z2A的功能提供了实验基础。
【关键词】疱疹病毒4型人潜伏膜蛋白2A 基因BZLF1 基因融合表达载体［ABSTRACT］ObjectiveTo construct Z2A recombinant adenovirus vector and study the effect of Z2A expression on EBV associated tumor. MethodsBoth LMP2A and BZLF1 cDNA were cloned from B958 cell line by RT PCR, and the fusion gene (LMP2A linker BZLF1) wasconstructed by using a polypeptide linker (Gly4Ser)3. Z2A vector pAdZ2A was constructed by inserting the Z2A fusion gene into pAd easy1 eukaryotic expressing plasmid, 293 cells were transfected with pAd Z2A. ResultsThe electrophoresis of EcoRV and BglⅡdigested products showed two DNA fragments which were 31 kb and 4.5 kb, respectively. The result of DNA sequencing demonstrated that Z2A had inserted in the expected site and the insertion sequence was exactly correct. The results showed that Z2A positive recombinant adenovirus could express Z2A. ConclusionZ2A recombinant adenovirus vector has been constructed and can be used for further research.［KEY WORDS］herpesvirus 4, human; LMP2A; gene, BZLF1; gene fusion; expression vectorEB病毒（EBV）是具有B淋巴细胞嗜性的疱疹病毒，为重要的DNA致瘤病毒，与多种人类恶性肿瘤,如Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌（NPC）、何杰金病、免疫缺陷病人的B淋巴细胞瘤、胃癌及肝癌等的发生有关。
EBV对宿主细胞的感染有潜伏感染和裂解期感染两种类型。
研究表明，EBV阳性癌组织中主要以潜伏感染的形式存在，EBV 基因组存在于几乎所有的癌细胞，因此可以EBV基因组或编码产物为靶点对EBV相关肿瘤进行特异性治疗[1～3]。
本研究拟将EBV潜伏膜蛋白2A(LMP2A)编码基因和即刻早期基因(BZLF1)进行融合，进而构建融合基因的重组腺病毒表达载体，为进一步探讨融合基因表达对EBV阳性肿瘤细胞增殖的影响提供实验基础。
现将结果报告如下。
1 材料和方法1.1 主要试剂、质粒和细胞株本文T4 DNA连接酶、λDNA/HindⅢ、DL2000 Marker、限制性内切酶EcoRⅤ、BglⅡ均购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA转染试剂盒lipofectamine 2000 购自Invitrogen公司；质粒提取试剂盒为Promega公司产品。
携带GFP报告基因的腺病毒穿梭质粒pAdTrack CMV，E1 区和E3 区缺失的复制缺陷5型腺病毒骨架质粒pAdeasy 1，大肠杆菌BJ5183和DH10B以及人胚肾293细胞由中国疾病控制中心性病艾滋病中心病毒免疫室邵一鸣教授惠赠。
EBV阳性B958细胞系日本鸟取大学医学部生体情报学教室西连寺刚教授惠赠。
1.2 引物设计根据LMP2A和BZLF1开放读码框序列[4，5]，DNAStar软件设计扩增EBV LMP2A和BZLF1基因的特异性引物，并在LMP2A上游引物的5′端引入BglⅡ酶切位点和保护性碱基GGC，下游引物3′端删除终止密码TAA，引入linker；BZLF1下游引物5′端引入EcoRⅤ酶切位点和保护性碱基GC，上游引物3′端引入linker。
linker(Gly4Ser)3为编码15个氨基酸组成的疏水性多肽的DNA序列，序列为5′GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGA AGCGGCGGTGGCGGCAGC3′。
LMP2A上游引物P1序列为：5′GGCAGATCTATGGGGTCCCTAG AAATGGTG3′，下游重叠引物P2序列为：5′GCT GCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCTACAGTGTTGCGATATGGGGT3′。
BZLF1上游重叠引物P3序列为：5′GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTG GCGGCAGCATGATGGACCCAAACTCGAC3′，下游引物P4序列为：5′GCGATATCTTAGAAAT TTAAGAGATCCTCGTG 3′。
引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成（PAGE纯化），扩增产物LMP2A长为1 545 bp，BZLF1长为791 bp，融合基因长为2 291 bp。
1.3 LMP2A和BZLF1基因的扩增采用TRIzol一步法提取B958 细胞总RNA，参照逆转录试剂盒要求的标准条件合成cDNA用作PCR反应模板。
PCR反应体系容量为25 μL，包括10×buffer 2.5 μL，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，上下游引物各0.3 mmol/L，Taq 1 U，cDNA 2 μL，无菌去离子水补至25 μL。
反应条件为：94 ℃预变性5 min；然后94 ℃、60 s，55 ℃、60 s，72 ℃、90 s，扩增35个循环；最后72 ℃延伸10 min。
PCR扩增产物于含溴化乙锭（0.5 mg/L）的8 g/L琼脂糖凝胶中电泳30 min，紫外线透射仪下观察电泳结果。
1.4 目的基因的TA克隆和测序分别将LMP2A和BZLF1的PCR扩增产物插入高效克隆载体pMD18T，转化E.coli JM109感受态细菌中，在含有X gal和IPTG 的氨青霉素LB平板上进行蓝白斑选择。
TA LMP2A和TA BZLF1阳性克隆由上海生物工程技术有限公司进行DNA序列测定，测序结果与GenBank中EBV标准株LMP2A和BZLF1编码基因序列进行比对。
1.5 融合基因Z2A 的构建以TA LMP2A和TA BZLF1质粒为模板进行PCR扩增，结果分别获得带有linker互补序列的LMP2A和BZLF1片段。
将LMP2A 和BZLF1的PCR产物行琼脂糖凝胶电泳后回收纯化，以其为模板在编码(Gly4Ser)3多肽的DNA片段连接下，根据重叠延伸原理进行基因重组[7]，获得Z2A融合基因片段。
将纯化后的Z2A融合基因片段插入TA载体，提取质粒DNA分别进行酶切鉴定和DNA序列分析。
1.6 重组腺病毒pAd Z2A的构建融合基因Z2A和腺病毒穿梭质粒pAd CMV分别用EcoR Ⅴ和BglⅡ进行双酶切，连接后转化DH5α，培养后挑取白色单菌落，小量提取质粒DNA进行pAdTrack CMV Z2A重组体的PCR筛选及酶切鉴定。
重组pAdTrack CMV Z2A质粒用限制性核酸内切酶PmeⅠ酶切线性化，并用碱性磷酸酶将线性化质粒去磷酸化，与1 μL (0.1 μg)pAdEasy1质粒同时转化感受态E.coli BJ5183，将转化的BJ5183 感受态菌液涂布于含35 mg/L卡那霉素的LB平板，37 ℃培养16～20 h。
挑取较小菌落，在含卡那霉素（35 mg/L）的LB液体培养基中37 ℃振摇培养12～16 h，碱裂解法小量提取质粒DNA，用限制性内切酶PacⅠ酶切后电泳进行鉴定。
如果right arm和left arm同源重组，重组质粒用PacⅠ酶切可产生4.5 kb左右的DNA片段；如果right arm与ori 同源重组，酶切产物大小约3.0 kb，阳性质粒命名为pAd Z2A。
1.7 重组腺病毒的制备在25 cm2培养瓶中接种293细胞，当细胞生长至约为50%～70%汇合时弃去培养基，按照脂质体转染试剂盒(lipofectamine 2000)使用说明将带有Z2A融合基因的重组质粒转染293细胞。
在观察到细胞荧光出现5～7 d后收获细胞，反复冻融3次裂解细胞，离心除去细胞碎片，取上清再次接种293细胞，如此重复3～4次。
1.8 RT PCR检测Z2A mRNA用重组腺病毒vAd Z2A感染293细胞，3 d后收集细胞，1 000 r/min离心10 min，弃上清。
采用TRIzol一步法提取细胞总RNA，将所获得RNA加入DNaseⅠ消化处理可能污染的DNA后进行RT PCR 检测。
取5 μL用DNaseⅠ消化处理的RNA直接作为模板进行PCR作为对照，PCR产物于琼脂糖凝胶中电泳检测鉴定。
2 结果2.1 目的基因的RT PCR扩增采用RT PCR技术自EBV阳性B958细胞扩增LMP2A和BZLF1编码序列cDNA ，PCR产物长分别为1 545 bp和791 bp，结果见图1。